水杨酸甲酯清除羟基自由基活性的研究马建华(集美大学生物工程学院 厦门 361021)马建华 女,48岁,教授,从事有机生物学的研究。
E -mail:ji anhuam1957@国家自然科学基金(30100035)、福建省自然科学基金(C0510029)及福建省教育厅(J A03134)资助项目2005-06-23收稿,2005-10-23接受摘 要 利用脉冲辐解技术研究了水杨酸甲酯清除羟基自由基反应的瞬态吸收谱,测定了水杨酸甲酯与羟基自由基反应的表观速率常数。
辅以常规检测方法,测定了水杨酸甲酯对羟基自由基的清除率。
结果表明,水杨酸甲酯能快速有效清除羟基自由基。
探讨了水杨酸甲酯清除羟基自由基的反应机制。
关键词 水杨酸甲酯 羟基自由基 脉冲辐解Study on the Scavenger Activities of Methyl S alicylateagainst Hydroxyl RadicalMa Janhua(Collegy of Biology Engineerin g ,Jimei Universi ty,Xiamen 361021)Abstract The scavenger activities of methyl salicylate towards the hydroxyl radical and its reaction mechanis m werestudied using pulse radiolytic technique and general test method.The apparent rate cons tan ts for reactions of hydroxyl radical and methyl salicylate were determined by growth trace of transient absorp tions arising from the scavenging of hydroxyl radical by methyl salicylate.Thus methyl salicylate is a good an tioxidant.Key words Methyl salicylate,Hydroxyl radical,Pulse radiolysis活性氧自由基能够引发癌症、自身免疫性疾病、炎症、肿瘤、心肌与脑损伤等性能已被生物医学界所证实,羟基自由基在活性氧自由基中反应活性最强、毒性最大,挖掘开发活性氧自由基清除剂尤其天然活性氧自由基清除剂是多年来医学界的研究热点[1~3]。
水杨酸甲酯天然存在于冬青叶中,是冬青油的主要有效成分,此外,还存在于樱桃、草莓、苹果等,其多种药理功能如消炎、抗菌、止痛等功能已被证实[4]。
目前尚未见其对活性氧自由基反应活性的研究报道。
根据其酚型结构特点,酚羟基脱氢可以形成稳定的酚氧自由基,具有与活性氧自由基反应的结构特点。
本研究通过水杨酸甲酯(MS)对羟基自由基的清除性能研究,证实水杨酸甲酯具有抗活性氧自由基的功能。
1 实验部分1.1 仪器与药品UV -120-02紫外可见分光光度计,10MeV 电子直线加速器。
水杨酸甲酯,硫酸亚铁、过氧化氢、正丁醇、甲苯、吡啶、二甲亚砜、坚牢蓝BB 、硫酸均为分析纯。
试剂用去离子水配制。
1.2 方法1.2.1 毫微秒级脉冲辐解瞬态吸收光谱 将研究对象置于石英样品池内,用脉冲电子束辐照样品池,样品经辐照后产生短寿命瞬态产物,分析光以垂直于电子束的方向通过样品池,经样品以及瞬态产物吸收过的分析光由单色仪分成单色光,再经光电倍增管转变为电信号,电信号由HP54510B 300Hz 瞬态记#228#化学通报 2006年第3期 http:P P 录仪经过A P D 转换成数字信号存于计算机内,最后用计算机处理数据。
所用的石英样品池沿分析光方向长20mm,脉冲电子束方向为10mm,分析光源为500W 氙灯,单色仪型号为44W,瞬态记录仪的频率可调,最高频率为300MHz 。
脉冲辐解实验所使用的加速器为10Me V 电子直线加速器,电子脉冲宽度为8~10ns 可调,单脉冲剂量为10~40Gy 可调,脉冲电流为2~3A,以N 2O 或空气饱和10mmol P L KSC N 水溶液作为化学剂量计,取E (SCN)-2(480nm)=7600L -1#mol -1#cm -1。
1.2.2 羟基自由基的产生与清除率测定[5] 羟自由基的测定方法有电子顺磁共振法、高效液相色谱法和化学发光法等。
这些方法大多需要较昂贵的仪器,操作也较复杂,一般实验室难以应用。
可用二甲亚砜作为水相中#OH 产生的分子探针,定量测定#OH 的产率。
该法的测定原理为:Fe 2++H 2O 2 Fe 3++OH -+#OH(1)C H 3SOC H 3+#OH CH 3SOOH+#CH 3(2)C H 3SOOH +Ar )N N + Ar )NN )S O O CH 3+H +(3)Fenton 反应产生的羟自由基与二甲亚砜反应,生成甲基亚磺酸,再与坚牢蓝BB 盐反应生成偶氮砜,比色法测定其含量可间接测定#OH 的生成量。
在上述体系中加入一定量的水杨酸甲酯,测定吸光度A S ,按下式计算水杨酸甲酯对羟基自由基的清除率:清除率P %=(A o -A S )P A o @100%(4)式中A 0为不加清除剂时测定得到的吸光度,A s 为加入清除剂时测得的吸光度。
2 结果与讨论2.1 水杨酸甲酯与羟基自由基反应的瞬态吸收谱2.1.1 羟基自由基的产生[4] N 2O 饱和的水溶液经电子束辐解后产生的主要初级活性自由基有#OH 、e aq -和#H :H 2O #OH+e aq -+#H(5)e aq -则可被N 2O 转换成#OH:e aq -+N 2O+H 2O #OH+OH -+N 2(6)2.1.2 水杨酸甲酯清除羟基自由基瞬态吸收谱 N 2O 饱和的1@10-4mol #L -1水杨酸甲酯水溶液于电子脉冲结束后在5L s 和15L s 观察到的瞬态吸收谱如图1所示。
在320nm 和380nm 观察到两个宽而强的吸收峰。
320nm 、380nm 吸收峰被归属为水杨酸甲酯酚氧自由基(Ph MS O #),这是羟基自由基进攻水杨酸甲酯分子结构中酚羟基,抽氢所形成[4,6]。
320nm 、380nm 瞬态粒子的产生主要来自以下过程:MS+#OH Ph MS O #+H 2O (7)脉冲辐解N 2O 饱和的1@10-4mol #L -1水杨酸甲酯水溶液(pH 7.3),所产生的Ph MS O #在320nm 、380nm 处观察到的动力学生成曲线如图2所示。
图2显示在10L s 时间内Ph MS O #吸收随时间而上升,约在12L s 基本趋于稳定。
由此动力学生成曲线测得Ph MS O #的表观生成速率常数为4.25@105mol #L -1。
2.2 稳态方法测定水杨酸甲酯对羟基自由基的清除效果羟基自由基的产生:在10mL 刻度具塞试管中,加入2mL 200mmol P L 的二甲亚砜、1mL 0.1m mol P L 的HCl 、215mL 18mmol P L FeSO 4,再加入3mL 80mmol P L 的H 2O 2启动反应。
加去离子水补充至刻度,混匀。
羟基自由基的测定[5]:取1mL 上述混合液,加入2m L 15mmol P L 坚牢蓝BB 盐。
在室温黑暗中反应10min 。
再加1mL 吡啶使颜色稳定,然后加3mL 甲苯P 正丁醇(3P 1)混合液,充分混合,静置分层。
下层相#229#http:P P 化学通报 2006年第3期图1 N 2O 饱和的1@10-4mol #L -1水杨酸甲酯与012m ol #L -1异丙醇水溶液(pH 7.3)于电子脉冲5L s 、15L s 时观察到的瞬态吸收谱Fig.1 The transient absorption spectra from pu ls e radiolysis of1@10-4mol #L -1methyl s alicylate,and 012mol #L -1i -PrOHaqueous solution (pH =7.3),saturated with N 2Oo 5L s,p 15Ls 图2 脉冲辐解N 2O 饱和的1@10-4mol #L -1水杨酸甲酯水溶液(pH 7.3)在320n m 处观察到的Ph MS O #的动力学生成曲线Fig.2 Pulse radiolysis of 1@10-4mol #L -1methyl s alicylate aqueous solution(pH =7.3),s aturated with N 2O ,growth trace of Ph MS O #absorption at 320nm中含有未反应的偶氮盐,用吸管移走弃掉。
甲苯P 正丁醇相用5mL 经正丁醇饱和的水冲洗,移去未反应的偶氮盐,将上清液移到比色皿中,于420nm 测定吸光度A o 。
在上体系中加入一定浓度的水杨酸甲酯,按所述方法测定吸光度A S ,按式(4)计算清除率。
不同浓度水杨酸甲酯对羟自由基的清除率结果见表1。
表1 水杨酸甲酯对羟自由基的清除率测定结果Tab.1 The s cavenger rate of methyl salicylate towards the hydroxyl radical水杨酸甲酯浓度P (mmol #L -1)A S A 0清除率P %0.10.3350.93264.050.20.3270.93264.910.40.3010.93267.700.60.2530.93272.850.80.1630.93282.50水杨酸甲酯微溶于水(<1mmol #L -1),然而表1所示结果表明,反应体系中浓度为0.8m mol #L -1的水杨酸甲酯,其对羟基自由基的清除率就已达到82.5%。
可见,水杨酸甲酯对羟基自由基具有显著的清除效果。
3 结论水杨酸甲酯能快速、高效率地清除羟基自由基。
这一研究结果为水杨酸甲酯具有抗氧化、抗辐射功能提供了有力的证据。
预计水杨酸甲酯作为天然抗氧化、抗辐射剂,将在医学、保健、化妆品等领域得以广泛的应用。
致谢:中国科学院上海原子核研究所苗金玲、林维真与姚思德研究员在脉冲辐解实验中予以指导帮助,在此深表感谢!参考文献[1] R A Floyd.FASEB.J.,1990,4:2587~2597.[2] B N Ames,L S Gold.Mutation Researc h,1991,250:3~16.[3] M J Davies,L G Forni,R L Wills on.J.Biochem.,1988,255(2):512~522.[4] 何坚,孙宝国.香料化学与工艺学)))天然、合成、调合香料.北京:化学工业出版社,1995:401~402.[5] 贾之慎,邬建敏,唐孟成.生物化学与生物物理进展,1995,23(2):184~186.[6] K Steen.Che m.Rev.,1989:503~520.#230#化学通报 2006年第3期 http:P P 。
![[整理版]水杨酸法测定羟自由基的清除能力实验](https://img.taocdn.com/s1/m/34058307a31614791711cc7931b765ce05087a01.png)
