两种检测高值甲胎蛋白出现钩状效应的方法研究

钩状效应致电化学发光法检测CEA假阴性1例钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。

当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量[1]。

钩状效应是影响定性和定量免疫学检测准确性的一种现象，此现象将导致血清标本定量检测不能准确地反映其真实浓度，常导致检测结果呈假低值和假阴性的错误[2]。

电化学发光法（ECLIA）作为最新的肿瘤标志物检测技术，敏感度高、精密度好、检测时间也大大缩短。

我们发现1例肝癌患者的CEA浓度超过1000 ng/ml，用化学发光免疫分析时结果严重偏低，现报告如下。

患者女，65岁，主因乏力3个月于2014年7月11日入院。

ID：331705。

患者于3个月前无明显诱因出现乏力，伴呃逆、腹胀、纳差，时有腹痛，以上腹为著，无发烧，无恶心、呕吐。

既往“甲亢”病史1年，否认高血压、冠心病、糖尿病病史。

否认肝炎、结核等传染病病史。

无食物及药物过敏史。

查体：T36.0℃，BP110/75mmHg，神志清，精神可，呼吸平稳，双肺呼吸音粗，未闻及干湿性啰音，心前区无隆起，心尖搏动不明显，心率80次/分，律齐，各瓣膜听诊区未闻及杂音，腹平软，上腹部压痛，无反跳痛及肌紧张，肝脾未触及，肝区叩击痛，肾区无叩击痛，移动性浊音阴性，双下肢无水肿。

辅助检查：上腹部MRI：肝脏多发性转移瘤，右肾小囊肿，T12椎体血管瘤；肝胆脾彩超：肝内多发实性占位（肝癌？）。

乳腺彩超：未见明显异常。

甲状腺彩超：甲状腺双侧多发结节，甲状腺左叶下部实性结节伴粗大钙化。

实验室检查：血常规WBC6.83×109/L，Hgb133g/L，PLT177×109/L，尿常规及大便常规正常。

生化：肾功能正常。

血脂正常。

ALT65U/L，AST106 U/L，TP62.6 g/L，ALB33.7 g/L，TBIL10.1umol/l，DBIL2.8 umol/l，BS4.62 mmol/l，CK63 U/L，CK-MB46 U/L，LDH555 U/L，α-HBDH456 U/L，K4.37 mmol/l，Na137.2 mmol/l，Cl 97.2 mmol/l，TCO224.9 mmol/l，Ca2.11mmol/l，P1.35mmol/l，Mg0.69mmol/l。

钩状效应是指在双抗体夹心法测抗原的一步法ELISA中，测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直到不显色，而出现假阴性结果。

抗原抗体最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1。

曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of equivalence）。

在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。

如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zone phenomenon）。

抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。

在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。

图1沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系（RF）的双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。

洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2）加受检标本，保温反应。

标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。

洗涤除去其他未结合物质。

3）加酶标抗体，保温反应。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

4）加底物显色。

固相上的酶催化底物成为有色产物。

通过比色，测知标本中抗原的量。

在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。

只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。

如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。

这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。

在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。

高剂量钩状效应试验方案一、试验目的。

咱们这次试验呢，就是想搞清楚高剂量下的钩状效应到底是咋回事。

简单说，就是看看在给了超大量的某种东西（这里先不具体说是啥，反正是咱们要研究的对象）的时候，检测结果会不会变得很奇怪，就像鱼钩弯了之后把鱼弄跑了一样，检测结果跑偏了。

二、试验材料。

1. 样本。

找一堆含有咱们要检测物质的样本。

这些样本呢，来源可以多样，比如说从医院收集来的患者样本（当然要经过同意啦），或者自己合成一些含有不同浓度这种物质的模拟样本。

2. 检测试剂。

选用专门检测这个物质的试剂，而且要质量靠谱的。

不同品牌、不同批次的最好都准备一些，这样才全面嘛。

3. 仪器设备。

检测用的仪器，像那些精确的测量仪之类的，要提前校准好，就像给运动员调整好起跑器一样，让它能准确地工作。

三、试验分组。

1. 低剂量组。

这个组就是用来做对比的，给样本里加一点点咱们要检测的物质，按照正常的检测范围来加。

这就好比是正常钓鱼的时候用正常大小的鱼饵。

2. 高剂量组。

这个就是咱们的重点啦。

在样本里疯狂加要检测的物质，加到比正常检测范围高好多好多倍，看看这个时候检测结果会不会“抽风”。

就像是给鱼钩挂上超级大的鱼饵，看鱼会不会被吓跑或者发生啥奇怪的事儿。

四、试验步骤。

1. 样本准备。

对于低剂量组的样本，按照试剂说明书上推荐的最低检测浓度，小心翼翼地把要检测的物质加进去，搅拌均匀。

这就像给一杯咖啡加一点点糖，轻轻搅匀。

高剂量组的样本就豪放多啦，一股脑地把超多的要检测物质加进去，加到你觉得已经很夸张的程度。

然后同样搅拌均匀，不过这个时候可能搅拌得要更用力些，毕竟东西多嘛。

2. 检测操作。

把准备好的样本分别放到检测仪器里，用选好的试剂按照标准检测流程来操作。

这个过程就像是把菜放进锅里炒一样，得按照菜谱（检测流程）来，不能乱搞。

在检测的时候，要多做几次平行试验。

比如说每个样本都检测个三五次，这样结果才更靠谱，就像考试多做几遍检查一样。

五、结果观察与记录。

高剂量钩状效应判定方法
以下是 6 条关于“高剂量钩状效应判定方法”的内容：
1. 你知道吗，看曲线变化就是个很关键的方法呀！就好像你走在路上看不同的风景变化一样。

比如说在检测时，如果曲线突然出现异常的波动，那可就得高度警惕了，这说不定就是高剂量钩状效应在搞鬼呢，你遇到过这种情况吗？
2. 嘿，还有观察数值的异常啊！这就像是在茫茫人海中一下子发现那个特别不一样的人。

当数值突然变得特别夸张，和正常范围相差甚远，那很可能高剂量钩状效应就冒出来啦，这多明显呀，你不会看不出来吧？
3. 听好啦，对比不同批次的结果也超重要的哦！这就跟对比不同季节的衣服一样。

如果这次的结果和之前的差异巨大，那很可能就是高剂量钩状效应在捣乱呀，是不是很简单易懂呢？
4. 哇塞，注意检测过程中的细节也能发现端倪呀！好比破案找线索一样。

比如试剂的状态、操作的规范程度等等，任何一个小细节出问题都可能引发高剂量钩状效应，难道你平时都不注意这些吗？
5. 还有啊，多和标准样本进行比较也能看出门道呢！就如同照镜子看自己一样。

要是和标准样本差别很大，那可就要小心是不是高剂量钩状效应在作祟啦，这你得记住呀！
6. 最后，不要忘了结合多种方法来综合判断哟！这就像拼图一样，把各种线索拼在一起。

单一方法可能不准确，但多种方法结合起来就能更准确地判断高剂量钩状效应啦，这么重要的事可千万不能马虎呀！我觉得这些方法真的挺实用的，只要用心去观察和判断，就一定能避开高剂量钩状效应的陷阱呢！。

钩状效应试验方案一、试验目的。

咱们这次试验啊，就是要搞清楚钩状效应到底啥时候出现，怎么出现的，就像侦探破案一样，把钩状效应这个“小怪兽”的规律找出来。

二、试验材料。

1. 样本。

我们得准备一些不同浓度的目标检测物的样本。

比如说，低浓度的样本就像一群小喽啰，高浓度的样本那就是大boss啦。

这些样本可以是从已知浓度的标准品稀释来的，也可以是从实际的临床样本（如果合适的话）中挑选不同浓度的。

2. 检测试剂。

这就好比我们的武器，用来检测目标物的试剂得选好。

要确保这个试剂在正常情况下是靠谱的，能准确检测出目标物的含量。

三、试验设备。

1. 检测仪器。

这个仪器就像一个超级放大镜，能让我们看到样本里目标物的情况。

要保证仪器已经校准好，这样测出来的数据才准确。

就像给枪校准准星一样，不然打偏了可不行。

四、试验步骤。

# （一）样本准备。

1. 对于标准品。

咱们先从高浓度的标准品开始，就像从山顶开始探索一样。

把这个高浓度的标准品按照一定的比例逐步稀释，就像把一大杯果汁不断加水变淡。

稀释成好几个不同浓度的样本，从超级浓到比较淡的都要有。

2. 对于临床样本（如果用的话）先对临床样本进行初步检测，挑出那些浓度看起来比较高、比较中等和比较低的样本，就像在一群人中挑出高个子、中等个子和矮个子一样。

# （二）检测操作。

1. 从低浓度样本开始检测。

把准备好的最低浓度的样本放到检测仪器里，用我们选好的检测试剂按照说明书的步骤进行检测。

这就像是给小喽啰过安检一样，看看能检测出多少目标物。

记录下检测结果，包括数值啊、检测时间啊之类的信息，就像给小喽啰拍个照片做记录。

2. 逐步检测更高浓度的样本。

按照浓度从低到高的顺序，一个一个地把样本放到仪器里检测，每次都像前面一样认真记录结果。

这时候浓度越来越高，就像遇到越来越厉害的敌人，看看我们的试剂和仪器能不能应付得来。

3. 重点关注高浓度样本。

当检测到比较高浓度的样本时，要特别小心啦。

因为钩状效应很可能就在这个时候冒出来。

抗原elisa双位点一步法测定中钩状效应与对策
抗原ELISA双位点一步法是一种常用的实验方法，用于检测抗原与抗体之间的相互作用。

在实验过程中，可能会出现钩状效应，这会影响实验结果的准确性。

以下是钩状效应的解释和对策：
钩状效应是指在ELISA实验中，当抗原浓度较低时，检测结果会出现一个不规则的曲线，其中抗原的浓度呈现出比预期更高的信号强度。

这种现象可能是由于抗原与抗体之间的结合造成的，导致抗原与抗体的结合部分被遮盖，难以被检测到。

这会导致低抗原浓度的误判和结果不准确。

为了避免钩状效应的影响，可以采取以下对策：
1. 选择适当的抗体：首先要选择高亲和力的抗体来进行实验，这有助于提高检测的灵敏度和准确性。

2. 优化反应条件：在实验过程中，可以调整反应条件，如反应温度，时间和缓冲液的pH值等，以尽可能减少钩状效应的发生。

3. 适当稀释样品：在实验中，可以适当稀释样品来降低抗原的浓度，从而减少钩状效应的影响。

4. 使用另一种检测方法：如果钩状效应难以避免，可以考虑使用其他检测方法，如Western blot或免疫印迹等。

总之，钩状效应可能会影响抗原ELISA双位点一步法的准确性，但通过选择适当的抗体，优化反应条件，适当稀释样品和使用其他检测方法等对策，可以降低钩状效应的影响，提高实验结果的准确性。

警惕化学发光检测中的“钩状效应”化学发光法具有高灵敏度和高特异性，可以定量检测多种激素、肿瘤标志物、感染性疾病标志物等，为很多疾病的诊治提供了极大的便利。

近年来，在我国各级医院中化学发光分析仪逐渐得到普及，使其与血液分析仪、生化分析仪等一样，成为检验科的标配和主力仪器。

化学发光仪及其配套试剂的生产厂商中，既有各大国外品牌，也有诸多国内后起厂商。

笔者所在医院，虽地处西北小城，但也赶上了这股“春风”，除了原有的罗氏电化学发光分析仪e411和e602外，最近又新添了一台国产化学发光分析仪（以下称“A仪器”），其主要用于性激素六项和感染性疾病标志物的检测。

化学发光法的普遍应用，虽然为疾病的诊治提供了强有力的支持。

但是，与许多实验室检测方法一样，化学发光法在实际应用中会受到一些因素的明显干扰，检验人员和临床医师如不能对这些潜在的干扰因素存在认知，就很有可能导致误诊误治，使患者权益受损，并为医疗纠纷埋下隐患。

下面就对近期笔者遇到的一例异常结果，及其背后的干扰因素叙述如下，希望能对诸位读者起到一点警示作用。

案例描述一份妇科住院患者的血清人绒毛膜促性腺激素（HCG）标本，在罗氏e602上第一次测得的结果为>10000mIU/mL, 进而选择1:20仪器自动稀释后，结果为>200000mIU/mL。

为了看一下对于这样高值的标本，装机时间不长的A仪器表现如何，我们把原血清放到了A仪器上检测，却测出HCG为6647 mIU/mL。

同一份标本怎么会有如此大的差异呢？通过查询得知，该患者的临床诊断是葡萄胎，那么HCG浓度明显偏高是很有可能的。

因此，在e602上对该标本进一步稀释后，最终得到HCG浓度是1246970mIU/mL，我们将此结果报告临床。

之后在A仪器上，选择自动1:100稀释后，也测得HCG为553951mIU/mL。

可见A仪器在未稀释时，测出的6647mIU/mL是一份“虚假”的低值结果。

六天后，该患者复查HCG，结果为8565mIU/mL（未稀释，E602测得）。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1880959A [43]公开日2006年12月20日[21]申请号200510026872.6[22]申请日2005.06.17[21]申请号200510026872.6[71]申请人上海透景生命科技有限公司地址201203上海市浦东张江高科技园区松涛路646号[72]发明人姚见儿 周雪雷 罗朝领 茅柳娟 [74]专利代理机构上海专利商标事务所有限公司代理人徐迅[51]Int.CI.G01N 33/543 (2006.01)G01N 21/00 (2006.01)权利要求书 2 页 说明书 20 页[54]发明名称一种指示高剂量钩状效应的方法[57]摘要本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种在免疫检测样本时指示高剂量钩状(HD－HOOK)效应的方法和相应的试剂盒。

200510026872.6权 利 要 求 书第1/2页 1、一种检测样品中目标抗原的免疫夹心检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将样品、检测微球和标记了可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系，其中所述的检测微球是如I式所示的第一抗体-微球的二元复合物， anti1X-bead (I)式中，“X”表示目标抗原，“anti1X”表示针对所述目标抗原“X”的第一抗体，“bead”表示微球，“-”表示第一抗体与微球之间的结合方式， 并且所述的第二抗体与第一抗体可同时结合于目标抗原的不同表位， 从而形成“第二抗体-抗原-第一抗体-微球”四元复合物；(b)将指示微球加入到步骤(a)的体系中，其中指示微球是式II所示的目标抗原-微球的二元复合物，X-bead’ (II)式中，“bead’”表示可与“bead”互相区别的不同微球，“-”表示目标抗原X与微球之间的结合方式，从而在带有可检测信号的第二抗体存在下，形成“第二抗体-抗原-微球”三元复合物；(c)检测反应体系中所述四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，从而确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量； 并且检测反应体系中所述三元复合物中微球上的可检测信号，得到指示微球的信号值，并与无HD-HOOK效应时的指示微球信号值(正常值)比较，当指示微球测量值小于指示微球正常值时，则判定目标抗原的测定结果不可靠；如果指示微球测量值大于或等于指示微球正常值时，则判定样品中目标抗原的浓度处于可测量范围。

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2018.12.019钩状效应对化学发光法测定甲胎蛋白的影响与解决方案探讨崔怀中　王　莹　孙少丹　(杭州市西溪医院杭州市第六人民医院检验科,杭州310023) 中图分类号　R446.61 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2018)12⁃1854⁃03作者简介:崔怀中,男,主管技师,主要从事临床免疫及生化检验方面的研究,E⁃mail:149731677@[摘　要]　目的:探讨钩状效应对化学发光法测定甲胎蛋白(AFP)的影响与解决方案㊂方法:将所有AFP 仪器测定结果>2000ng /ml 标本都进行稀释重测㊂结果:39484份标本中发现3例由于钩状效应而导致的错误结果㊂结论:当前的仪器和试剂无法对超高浓度AFP 标本进行正确的测定或提示,必须对化学发光法测定AFP 时可能存在钩状效应而导致错误结果的现象引起重视㊂[关键词]　化学发光免疫分析;甲胎蛋白;钩状效应Effect of hook effect on determination of alpha fetoprotein by chemiluminescence and solutionCUI Huai⁃Zhong ,WANG Ying ,SUN Shao⁃Dan .The Laboratory of Xixi Hospital of Hangzhou (The Sixth People′s Hospital of Hangzhou ),Hangzhou 310023,China[Abstract ]　Objective :To explore the effect of hook effect on the determination of alpha⁃fetoprotein (AFP )by chemiluminescence and how to solve the problem.Methods :All the results of AFP instrument determination for >2000ng /ml specimens were measured with dilution and retest.Results :Three of the 39484specimens were found to be the result of the hook effect.Conclusion :The current instrument and reagent can not accurately determine or prompt the high AFP specimen,and it is necessary to pay attention to the phenomenon that the chemical luminescence method may have the hook effect.[Key words ]　Chemiluminescence immunoassay;Alpha⁃fetoprotein;Hook effect 化学发光免疫分析(Chemiluminescence immuno⁃assay,CLIA)是化学发光与免疫分析相结合的一种分析方法㊂由于它具有灵敏度高㊁特异性好㊁分析速度快㊁操作简便等优点,近年来在临床诊断等领域中得到了广泛运用[1]㊂甲胎蛋白(Alpha⁃fetoprotein,AFP)是人类发现的第一个蛋白类肿瘤标志物,已广泛应用于肝癌的诊断和治疗监测[2]㊂钩状效应即Hook 效应是指免疫分析中由于抗原抗体比例不合适而导致的假阴性或测定值小于真实值的现象㊂抗原抗体特异性反应时,生成结合物的量与抗原抗体的比例有关㊂无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体,均只有在两者比例合适时才出现最显著的抗原抗体反应,否则将可能导致测定结果低于实际结果[3]㊂本文报告了使用CLIA测定AFP 过程中,由于钩状效应导致测定结果远远低于实际值的现象,并探讨针对该现象的解决方案㊂1　资料与方法1.1　资料　2017年6月18日在我院住院治疗的患者,男,40岁,临床诊断为肝恶性肿瘤,核磁共振(MRI)检查结果为: 肝脏右叶巨块型肝癌伴肝内弥漫多发转移结节,门脉内广泛癌栓形成,附见:两肺弥漫多发转移瘤”㊂2017年6月18日至2017年12月31日本院实验室进行AFP 测定的标本39484份㊂1.2　实验方法　抽取受检者清晨空腹静脉血约5ml 于含惰性分离胶的促凝管中,静置30min,待标本充分凝固后,4000r /min 离心10min 后上机检测㊂检测仪器为美国Beckman⁃Coulter DxI800全自动化学发光分析仪,试剂为原装配套试剂,批号625284㊂所有项目检测前均室内质控在控,所有操作严格按照标准操作说明书进行㊂2　结果2.1　钩状效应影响AFP 测定结果的发现过程及处理措施　该标本医生同时开了AFP 测定和AFP 稀释测定(仪器预置的稀释测定模式,稀释倍数为18倍),仪器测定的结果分别为2303ng /ml 和>54000ng /ml㊂由于两个结果间存在明显的逻辑错误,因此对该标本进一步进行手工的稀释测定,经500倍稀释后测得结果为1154772ng /ml㊂对于诊断为肝恶性肿瘤的患者来说,AFP 测定结果为2303ng /ml 是完全可能的结果,可见如果该标本医生没有同时㊃4581㊃中国免疫学杂志2018年第34卷表1　对AFP浓度为1154772ng/ml的标本进行梯度稀释后测定结果Tab.1　Determination of AFP concentration of1154772 ng/ml after gradient dilutionDilution method (serum∶dilution)Relative light unitby instrumentInstrument displayresults(ng/ml)Theoreticalconcentration(ng/ml)1∶117381506>30005773862∶117012470>30007698483∶115416133>30008660794∶115337849>30009238185∶115043745>30009623106∶11405246328719898057∶113654465275510104268∶11324554626071026464Undiluted1235541223031154772 Note:The method of determination is to dilute the specimen with the above ratio and then use the built⁃in dilution mode of the instrument.开AFP稀释测定,实验室将很有可能报告出一个错误的结果㊂为避免可能错误的发生,通过和仪器厂家工程师的沟通,我实验室决定将此后AFP> 2000ng/ml的标本全部在仪器上进行稀释模式复测㊂从2017年6月18日至2017年12月31日本院实验室共测定AFP标本39484份,其中大于2000ng/ml标本200份,144份标本仪器直接给出了>3000ng/ml的结果㊂对其他56份仪器测定结果为2000ng/ml以上的标本,经稀释复测后发现由于钩状效应而导致的错误结果标本㊂期间对仪器测定结果为1000~2000ng/ml的标本,由于此结果段内标本数量较多,采用随机抽取的方式抽取了100份标本进行稀释复测,未发现由于钩状效应而导致的错误结果㊂2.2　对高浓度标本进行梯度稀释后测定结果　对AFP浓度为1154772ng/ml的标本进行梯度稀释,当血清量与稀释液量为6∶1时开始出现由于钩状效应而导致的错误结果,此时稀释后标本的理论浓度为989805ng/ml㊂3　讨论钩状效应可导致测定结果偏离实际值,如果实验室人员没有发现则可能发出错误的报告而影响到患者的诊断和治疗,因此钩状效应是免疫法测定中必须重视的问题㊂化学发光法作为免疫分析的一种,必然也会存在钩状效应[4]㊂DxI800全自动化学发光分析仪为避免钩状效应对测定结果的影响,当测定时如果仪器测定的相对光单位(Relative light unit,RLU)大于一定的值时,仪器会直接给出>3000ng/ml的结果,而不给出具体的数值㊂但是如果AFP浓度过高则可能由于严重的钩状效应使仪器给出一个错误的结果[5]㊂由于AFP在不同的肝癌患者中可能存在着巨大的差异,因此单从临床诊断上通常难以发现错误的存在㊂所以笔者所在实验室通过对所有测定值> 2000ng/ml的标本进行稀释复测,在39484份标本中发现3份标本由于显著的钩状效应而得出了错误的结果㊂虽然所占比例不足万分之一,但测定结果与真实结果相差巨大,如果发出这样的错误报告很可能对临床诊断和实验室声誉造成巨大影响,因此必须引起重视㊂在AFP试剂的说明书中提到 达到500000 ng/ml时,AFP测定不会表现出钩状效应”,可见当AFP浓度>500000ng/ml时就可能存在钩状效应,但说明书中并未对AFP浓度极高时仪器可能给出完全错误的结果进行明确的说明㊂根据本研究对极高浓度标本进行梯度稀释测定的结果,可见当AFP浓度> 989805ng/ml时就会由于钩状效应,仪器给出完全错误的结果㊂因此笔者所在实验室采取了对所有测定值>2000ng/ml的标本进行稀释复测,但目前所采用的>2000ng/ml必须稀释复测的规则只是基于本实验所发现的由于钩状效应导致错误结果时仪器给出的结果均在2000ng/ml以上而定的,并无明确的理论依据㊂对于仪器测定值在2000ng/ml以下的标本,本实验室进行部分标本的抽样稀释复测中,未发现钩状效应的存在,但不能排除仪器测定结果为2000ng/ml以下时存在钩状效应的可能㊂因此还需要仪器生产商进一步改进仪器和试剂性能来避免此类错误的发生㊂AFP是目前应用最广泛的诊断原发性肝癌的肿瘤标志物,是临床公认的肝细胞肝癌诊断最敏感标志物之一,其不仅在筛查和诊断中起重要作用,同时对原发性肝癌患者的预后判断和治疗监测也起重要的作用[6,7]㊂其检测结果一直受到临床医生和患者的高度重视,其检测结果的稳定性和准确性与患者的治疗方案紧密相关,低于真实值的结果会给临床医生或患者错误的提示,延误治疗或影响疗效判断㊂因此,作为检验工作者必须要加强责任心,充分认识到仪器可能存在的局限性以及钩状效应可能对结果产生的严重影响㊂对可疑的结果要及时跟临床医生进行沟通并结合患者的病情及其他检查结果综合分析㊁讨论,必要时对标本进行复测或稀释后复测避免因钩状效应或其他原因导致检验结果的错报㊂参考文献:[1]　肖　勤,林金明.化学发光免疫分析方法的应用研究进展[J].分析化学,2015,43(6):929⁃938.Xiao Q,Lin JM.Advances and applications of chemiluminescence immunoassay in clinical diagnosis and foods safety[J].Chin J㊃5581㊃崔怀中等　钩状效应对化学发光法测定甲胎蛋白的影响与解决方案探讨　第12期Analytical Chem,2015,43(6):929⁃938.[2]　袁星星,姜菲菲,贾泳梅,等.血清铁蛋白和甲胎蛋白及甲胎蛋白异质体⁃单项与联合检测对原发性肝癌辅助诊断的临床应用价值[J].中华检验医学杂志,2016,39(8):604⁃608.Yuan XX,Jiang FF,Jia YM,et al.Diagnostic value of serum 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27项特定蛋白项目检测结果分析及钩状效应的防范方法杨杰;李茂城;尹小毛;张鹏;陈永强;曾方银【摘要】目的探讨免疫透射比浊法测定不同特定蛋白项目时抗原过量钩状效应的风险大小及防范方法.方法收集既往27项特定蛋白项目临床标本的测定结果 ,分析其最大可见浓度,并与国内外4个品牌产品说明书声明的分析测量范围相比较,计算超过测量范围上限的标本百分比.结果27个项目中类风湿因子(RF)、心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、C-反应蛋白(CRP)的最高值分别为13000.0 IU/mL、1600.1 ng/mL、344.0 mg/L、566.6 mg/L,超出参考区间上限的100倍以上.临床标本中β2-微球蛋白(β2-MG)、RF、视黄醇结合蛋白(RBP)、脂蛋白[Lp(a)]较易超出分析测量范围上限,分别占比21.7％、7.9％、7.6％、5.9％,发生高剂量钩状效应的风险较大.罗氏检测系统防范钩状效应的主要方法是样品预稀释和抗原过剩检查.结论部分免疫透射比浊测定项目发生高剂量钩状效应的风险较大,应采取不同方法保证结果的准确性.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2019(016)001【总页数】5页(P8-12)【关键词】特定蛋白;免疫透射比浊法;抗原过剩;钩状效应【作者】杨杰;李茂城;尹小毛;张鹏;陈永强;曾方银【作者单位】南方医科大学南方医院检验科,广州510515;南方医科大学南方医院检验科,广州510515;南方医科大学第五附属医院输血科,广州510900;南方医科大学南方医院检验科,广州510515;南方医科大学第五附属医检验科,广州510900;南方医科大学第五附属医检验科,广州510900【正文语种】中文【中图分类】R446.62特定蛋白是临床化学常见的检测项目，临床实验室目前检测特定蛋白常用的方法是免疫散射比浊法和免疫透射比浊法。

前者需要特定蛋白分析仪，且试剂、耗材成本高，影响其在临床的使用和推广。

自动生化分析仪自动识别免疫比浊分析中的钩状效应【提　要】　目的　探讨全自动生化分析仪上识别钩状效应的方法.方法　以IgG为检测对象，在HITACHI-7170A型全自动生化分析仪上，抗原抗体反应10 分钟，利用定时监测-时间反应进程曲线，分析其变化特征，选择钩状效应的识别参数 .结果　以反应时间(读点)20点的反应完成率(ABS20/ABS34)>0.9 0为限额参数，可自动识别钩状效应.结论?免疫比浊测定分析中的钩状效应，可通过正确的参数设置自动识别.时间反应进程曲线是识别钩状效应的基础，反应率是识别钩状效应的有效方法.【关键词】　免疫　比浊法　钩状效应　抗原　抗体［中图分类号］　R 392-33 ［文献标识码］　A ［文章编号］　1008-634X(2000)04-0252-03Automatic Check Method of Hook Effect in the Immunoassay withAutomatic Clinical Chemistry AnalysisLIU Zhong-min　GAO Yue-ting　CHEN Tao（Department of Laboratory,First Affiliated Hospital of Guangzhou MedicalCollege ,Guangzhou　510120 China）【Abstract】　Objective　To obtain automatic checck method of hook effec t in the turbibimetric immunoassay with automatic clinical chemistryanalysis.Methods　With model 7170A automatic clinical chemistry analyzer，the method and value of automatic check o f hook effect was obtained by assaying absorbance of immune complexes produced by which IgG of different concentratoin reacted with antibody for 10 minutes and t raced the relationship between the quantity of antigen and absorbance,and by an alyz ing charactreistics of reaction monitor curve of immunofraction and tracing the relationship between the quantity of antigen and hook efect,and by calculating c heck value of the hook effect.Results　The hook effect could be detected by aut omatic clinical analyzer if value,reaction rate of the 20th measurement point(AB S20/ABS34),was lower than 0.9.Conclusions　The c heck of ho ok effect in immunoreaction were performed by setting correctly limited value.R eaction monitor curve of immunoreaction was the basis of check of hook ef fect.T he comparison of reaction was a kind of effective method of the check of hoo k effect.【Key Words】　Immunoassay;　Turbibimetric;　Hook effect;　Ant igen;　Amtibody 免疫测定是利用抗原抗体反应检测标本中微量物质的方法.基于抗原抗体反应的敏感性和特异性，免疫测定的范围遍及医学检验的各个领域.任何物质只要能获得相应的特异性抗体，即可用免疫测定进行检测.抗原抗体反应是按一定的分子比例结合，当二者比例适中时，形成的免疫反应最强烈；当抗原或抗体过量时，免疫反应都将减弱［1］.因此，在自动生化分析仪上，正确判断抗原抗体反应体系中抗原与抗体的比例状态，识别钩状效应(hook effect)是否存在，直接关系到物质测定的准确性.本文以IgG为例，在全自动生化分析仪上，探讨利用定时监测-时间反应进程曲线的变化特征，正确设置自动识别钩状效应参数的方法.1　材料与方法1.1　参考物　免疫比浊法测定用C.f.a.s特种蛋白定标液，批号：19461304～1355279 ，德国Boehringer Mannheim公司产品，IgG参考定标值20.6g/L.1.2　试剂　全液体IgG免疫比浊法测定试剂盒，上海玉兰生物技术研究所生产.1.3　仪器　HITACHI 7170A型自动生化分析仪，日本Hitachi公司生产.1.4　方法　免疫透射比浊法，自编测定程序.1.5　主要参数　Cali.type:logit-log4P;Cali.Poin t:6;STD1 CONC.:0.00;STD2-6 CONC.:assigned value;Temperture：37℃;Reac tion time:10min;Assaymode:2Point End;Assay Point:1～34;Wave(Sub/Main):700/340;Sa mple Vol(μl):5-10-195;Reagent Vol:250;Unit:g/L;Expected Value:8.0～16.0;Inst[ BFQ].Factor:1.0;Technical Limit:0.1～3.0;SD Limit:0.1;Duplicate Limit:100;ABS.Limit:120002　结果与讨论2.1　剂量反应曲线与钩状效应分析　采用稀释和增加样本(抗原)用量的方法，获得一系列 IgG浓度值为0、2.06、4.12、6.18、8.24、10.3、20.6、30.9、41.2、51.5、103.0、154.5、206.0、257.5、309.0、360.5、412.0、463.5、515.0、566.5、618.0、669.5g/L的溶液，用免疫透射比浊法测定抗原抗体反应免疫复合物的生成量.以IgG浓度为横坐标，吸光度值ABS 为纵坐标1).绘制IgG剂量反应曲线图，结果(见图图1　IgG剂量反应曲线图Fig.1　IgG dose-effect relation curve 从图1可以看出，免疫透射比浊测定IgG的剂量反应曲线是一条双相反应曲线，即在恒定剂量的抗体溶液中加入不同剂量的抗原时，免疫复合物的生成量起初随抗原剂量的增加而增加；当达到峰值后，生成量随着抗原剂量的进一步增加反而减少.抗原抗体反应这一独特的现象可以用著名的“Heidel berger曲线”来描述［2］.曲线左侧为抗体过剩的测定区又称为前带，中间为抗体抗原浓度大致相等的等当量区又称为等价带，右侧为抗原过剩区又称为后带.当抗原抗体比例由抗体过剩到抗原过剩时，免疫复合物的生成量由上升到下降，剂量反应曲线呈钩状的现象，即为钩状效应.高剂量钩状效应使强阳性标本误测为弱阳性，以至假阴性结果.因此，高剂量钩状效应是免疫比浊测定中必须重视的问题.2.2　时间反应进程曲线与反应率分析　以IgG剂量反应曲线的拐点(顶点)为界，测定拐点左侧抗体过剩区和拐点右侧抗原过剩区抗原抗体反应10分钟，34个读点的吸光度值，绘制成时间反应进程曲线，观察不同的IgG浓度值标本的吸光度值随时间变化的特征，3).结果(见图2和图图2　抗体过剩时的时间反应进程曲线Antibodyexcess zone reaction monitor curveFig.2　图3　抗原过剩时的时间反应进程曲线Fig.3　Antigenexcess zone reaction Monitor curve 由于7170A型全自动生化分析仪的程序设置可分别在0、5、16、33读点加试剂，故以这些点表述时间反应进程曲线的特征.由图2可知，由于抗体过剩，5、16、33读点的吸光度值随抗原浓度增加而增加；其中， 5点之内的吸光度值增加迅速，16点时反应完成率(ABS16/ABS34)较高，其后的反应线较平直.而在图3中，由于抗原过量，使抗原抗体反应比例失调，免疫反应减弱，5、 16、33点值随抗原浓度增加而降低；其中，5点之内的吸光度值增加减缓，16点的反应完成率也逐渐下降.与图2比较，反应曲线有明显变化，曲线前段逐渐变得平坦，曲线后段向上延伸明显.由此可见，抗原过量时反应完成率下降，是测定过程中出现假性低值、影响临床对病情诊断的原因.正确认识和理解钩状效应前后时间反应进程曲线的变化特点，是正确识别钩状效应是否存在的基础和方法.2.3　检查钩状效应的方法选择　比较图2、图3时间反应进程曲线可以看出，抗体过剩区内，不同IgG浓度值的抗原抗体快速反应期的反应速率(ΔA=ABS x+1-ABSx,X≤5)和各个读点的反应完成率(ABS x/ABS34)均较抗原过剩区高.因此，可用计算快速反应期反应速率或反应完成率的方法判断钩状效应.但由于计算反应完成率法较计算反应速度法更简单、有效，故建议采用计算反应完成率法.2.4　检查钩状效应时间读点的选择　分别选取剂量反应曲线拐点左侧区内IgG浓度值为2.06、4.12、6.18、8.24、10.3、20 .6、30.9、41.2、51.5、103.0g/L的溶液，反应时间10min.由低到高分别求出不同IgG浓度值的34个读点的反应完成率(ABS x/ABS34). 通过分析图2和计算的各读点反应完成率发现，不同IgG浓度值的反应完成率均随反应时间的增加而增加；但在相同反应时间时，反应完成率有明显差异，且20读点以后的反应完成率均 >0.90.这说明，虽然所有的反应时间点都可以作为钩状效应检查的时间点，但如果以反应完成率达到0.90为检查点，检查的时间点应以20读点为好.2.5　检查钩状效应的限额参数计算　分别选取剂量反应曲线拐点左侧和右侧不同IgG浓度值的溶液，反应时间10min.由低到高分别求出不同IgG浓度值第20读点的反应完成率.其反应完成率分别为：拐点左侧：0 .90、0.92、0.92、0.91、0.93、0.94、0.94、0.95、0.94、0.92；拐点右侧：0.89、0.86、0.81、0.78、0.75、0.73、0.70、0.68、0.65、0.67、0.69.由此可见，剂量反应曲线拐点左侧不同IgG的浓度值的反应完成率均≥0.90；而拐点右侧不同IgG浓度值的反应完成率均<0.89.因此，0.90可作为自动别钩状效应的限额参数.2.6　有效工作剂量范围的确定　由于抗原抗体剂量反应曲线不是直线，用确定直线线性范围的方法，不适用于确定抗原抗体免疫反应的有效工作剂量范围，较理想的方法是用变异系数对分析物浓度绘制密度图(又称P-P图)，用最低可接受的精密度确定工作范围［3，4］.剂量反应曲线拐点左侧区内各浓度点的精密度图(见图4).由图4可看出，IgG 的有效工作剂量范围在4.12～41.2之间.低于或高于此范围浓度的样品，必须加倍或稀释后再测定 . 综上所述，抗原过量引起的钩状效应是免疫透射比浊测定中首先要解决好的问题. 用手工或仪器对样本进行前稀释或使用双份标本或用蛋白质试纸预测等方法，也可解决抗原过量问题 .但是，这些方法有时会导致抗原含量过低，造成抗体绝对过量，影响测定结果的准确性，或增加工作量和试剂成本而使其应用受到限制.因此，对有条件的实验室，在全自动生化分析仪上，应准确设置这些参数，自动识别钩状效应，以确保测.定结果的准确性图4　IgG测定精密度图Fig.4　Precision curve of IgG measurement刘忠民（广州医学院第一附属医院检验科　广州　510120）高月亭（广州医学院第一附属医院检验科　广州　510120）陈涛（广州医学院第一附属医院检验科　广州　510120）参考文献1，陶义训，储迅淘.免疫透射技术的进展及其在生化分析仪上的应用［J ］.临床检验信息，2000，7(1)：62，杨振修.免疫浊度测定法［J］.上海医学检验杂志，1997， 14(4)：2393，Robert S,Serum TM.Immunoassay Development［M］.In:J ames PG,Lw rence boratory analysis and clin appliations.Ist edition. 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ELISA法检测HBsAb产生钩状效应2例临床分析吕朝辉;范玉林;马晓红;盛小娟;宋茜【期刊名称】《中国肝脏病杂志（电子版）》【年(卷),期】2014(000)002【摘要】ELISA检测抗原抗体因其成本低、灵敏度高、特异性强等优点被实验室广泛应用。

由于目前多采用一步法检测，当血清中抗原抗体浓度过高时可能会产生钩状效应（HOOK效应），而引起假阴性[1-14]。

在采用一步法检测时，钩状效应很难被发现。

对此效应的报道主要集中在HBsAg的检测。

本课题组在临床工作中遇到两例体检者，应用ELISA一步法检测结果均提示HBsAb阴性，但被检测对象均对结果表示异议，自述3个月前曾检测HBsAb为弱阳性，并于当时分别注射过10μg乙肝疫苗。

后经倍比稀释[15]用ELISA一步法检测，确认其HBsAb为阳性，现报告如下。

【总页数】2页(P59-60)【作者】吕朝辉;范玉林;马晓红;盛小娟;宋茜【作者单位】解放军第522医院检验科，河南洛阳471003 1;解放军第522医院检验科，河南洛阳471003 1;解放军第522医院检验科，河南洛阳471003 1;解放军第522医院检验科，河南洛阳471003 1;解放军第522医院检验科，河南洛阳471003 1【正文语种】中文【相关文献】1.T P-ELISA 二步法检测梅毒螺旋体抗体产生钩状效应分析 [J], 林艳双;齐丽丽2.一步法检测梅毒抗体ELISA试剂的钩状效应分析 [J], 申旭霞;赵超芬;宋杨3.IRMA法检测乙肝表面抗原克服ELISA法的钩状效应 [J], 林德健;陈文4.HBV血清标志物ELISA检测法中的钩状效应 [J], 蔺承艳;钮琼5.TP-ELISA一步法在检测梅毒螺旋体抗体中的钩状效应分析 [J], 尹琦;徐玉婵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一步法测HBsAg产生钩状效应的原因分析及对策探讨
李曼;陈正徐;陈玉梅;郭丽;薛海南
【期刊名称】《医学检验与临床》
【年(卷),期】2004(015)006
【摘要】@@ 目前,国内检测HBsAg绝大多数采用ELISA中的双抗体夹心双位点一步法.该方法具有操作简单,反应时间短等优点.但当标本中的HBsAg浓度过高时,会因钩状效应出现弱阳性甚至假阴性而造成漏检,有报道漏检率达0.95%[1].本文通过分析钩状效应产生的原因,从众多纠正措施中选出金标法(胶体金标记试纸条法)和二步法,并探讨他们的临床应用价值.
【总页数】1页(P64)
【作者】李曼;陈正徐;陈玉梅;郭丽;薛海南
【作者单位】临沂市中医医院检验科,临沂,276002;临沂市中医医院检验科,临沂,276002;临沂市中医医院检验科,临沂,276002;临沂市中医医院检验科,临
沂,276002;临沂市中医医院检验科,临沂,276002
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.一步法检测梅毒抗体ELISA试剂的钩状效应分析 [J], 申旭霞;赵超芬;宋杨
2.神经性梅毒引起酶联免疫吸附实验一步法"钩状效应"3例 [J], 陈琪;董长林;杨勇;金晓东;袁梅
3.引起HBsAg钩状效应的原因探讨 [J], 周方满;鲁姣英
4.乙肝HBsAg一步法试剂钩状效应分析 [J], 魏廷恒;马琴花;房洁
5.TP-ELISA一步法在检测梅毒螺旋体抗体中的钩状效应分析 [J], 尹琦;徐玉婵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

甲胎蛋白测定1.方法：双抗体夹心法2.原理：采用双抗体夹心法原理，整个过程18分钟完成。

·第1步：10μl标本、生物素化的抗AFP单克隆抗体和钌（Ru）标记的抗AFP单克隆抗体混匀形成夹心复合物。

·第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。

·第3步：反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

·检测结果由机器自动从标准曲线上查出。

此曲线由仪器通过2点定标校正，由从试剂条形码扫描入仪器的原版标准曲线而得。

3.仪器及参数：Elecsys 2010技术参数系统 30个标本位15个试剂位最大吸样头上载量为 360个最大反应杯上载量为180只标本类型 血清和血浆控制单元 触摸屏系统接口 双向串型RS232接口4.应用试剂：4.1.瑞士罗氏4.2.直接上机使用4.3 试剂组成：M：链霉亲和素包被的微粒。

R1：生物素化的抗AFP单克隆抗体。

R2：Ru(bpy)2+标记的抗AFP单克隆抗体。

5.操作方法：详见 Elecsys 2010电化学发光仪操作规程6.临床意义：6.1检测范围：0.500─1000IU/ml 或 0.605-1210 ng/ml参考值646名健康人测定结果95%<=5.8IU/ml或<=7.0ng/m100%<=11.3IU/ml或<=13.6ng/ml6.2 意义：AFP来源于卵黄囊、未分化肝细胞和胎儿胃肠道。

70－95%的原发性肝癌患者的AFP升高，越是晚期，AFP含量越高。

但尚未发现AFP含量与肿瘤大小、恶性程度等有关系。

AFP含量显著升高一般提示原发性肝细胞癌。

在转移性肝癌中，AFP一般低于350-400 IU/ml。

AFP中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及HBsAg携带者。

不推荐将AFP用于普通人群的癌症筛查。

两种检验AFP方法的相关与回归分析
高云朝
【期刊名称】《放射免疫学杂志》
【年(卷),期】2008(021)004
【摘要】在定量免疫分析中，一个指标往往有多种检测方法，如放射免疫分析、酶联免疫分析、（电）化学发光免疫分析，等等，在试剂来源方面更是五花八门。

于是，同一个指标不同检测之间的相关性研究在学术期刊中经常见到，其中最多的是直线相关与回归分析。

例如，Roche Elecsys 2010电化学发光免疫分析法AFP 和Abbott IMX微粒子酶联免疫分析AFP，
【总页数】3页(P315-317)
【作者】高云朝
【作者单位】上海交通大学附属第六人民医院核医学科,200233
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.两种不同方法检验临床血脂相关指标的对比研究 [J], 向志华
2.基于磁颗粒与包被管两种固相载体的化学发光免疫分析方法检测人血清中的AFP 含量 [J], 张倩云;林金明
3.扰动顺序相关性的两种检验方法 [J], 王晨阳
4.检验数字影像相关生成的DEM数据精度的两种方法 [J], 秦丽萍
5.相对残差法线性回归与相关的理论研究──回归分析、相关模型及其假设检验 [J], 成军;孙关忠
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