细胞培养技术实用篇

原代培养的方法

悬浮细胞培养法 器官培养法 组织块培养法 细胞培养法
悬浮细胞培养法

对于悬浮生长的细胞．如白血病细胞、淋巴细 胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫
细胞无须消化，可采用低速离心分离,直接培
养。
器官培养(ORGAN CULTURE)
指组织、器官原基，以至整个器官或其
一部分在体外的维持或生长，它们可以
分化与保持原来的结构与功能。
细胞培养法方法与步骤
1) 动物处死：将出生2～3d乳鼠， 用脱颈方法处死。用酒精棉球 擦拭解剖部位。 2) 取材及剪切：在无菌条件下将 组织取出，臵于无菌培养皿中， 剪去多余的组织（脂肪等）， 用PBS液洗涤1-2次；放入另一 培养皿中，将组织剪成1mm3大 小的块。
后联合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白
酶液。
Optimal confluency for moving cells to a new dish is 70-80%
组织材料的分离

机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、 胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆 器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。

化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法
细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离
心法
细胞悬液的分离方法

低速离心法：
血液和体液等细胞悬液500-
从胞体长出.
培养液中需加入高浓度的葡萄糖, 以利于神经元的生长.
三、传代培养(PASSAGE OR SUBCULTURE)

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，
为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，
就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，
将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养
瓶即称为传代或传代培养(passage)。
3. 放大倍数：倒臵显微
镜； 4. 培养基种类：
1640+10%X小牛血清；
5. 细胞状态与特征简述: 细胞呈长梭形，贴壁生长
几种细胞的原代培养图示
神经元原代培养:神经元是高度分 化的细胞,在体外培养条件下难以 增殖.因此,目前神经元的培养主 要用于原代培养. 神经元胞体呈圆形或长杆状,核大 而圆,核仁明显.可见有细小突起
学试剂及有害药物如碘、汞等。

3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏 死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于
少量培养液中；
组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的
原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，
故也被称为组织培养(tissue culture)。
1000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过 长，会造成细胞损伤和死亡。

密度梯度离心法：
用离心法将细胞分到不同
密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适 于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll 400，Percoll，泛影葡胺等。
胰蛋白酶（TRYPSIN）



对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。 消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与 硬度有关。 适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离 肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。 而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、 子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效．但若与胶原 酶合用能增加其对组织的分离作用 。 钙镁离子和血清抑制其活性。 常用剂量为0.25%，PH8，温度37℃
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先 要点燃酒精灯。

按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近 处并经过烧灼进行。
如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞， 以防烧死细胞。

操作
进行培养时，动作要准确敏捷



不能太快，否则空气流动增加污染机会。
不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要 用火焰烧灼消毒或取备品更换。
细胞的传代培养
根据细胞生长的特点，传代方法有2种。 悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000rpm）去上清，沉淀物加
新培养液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培
养液去除l／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成细
胞悬液再传代。
细胞的传代培养
贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋 白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用 EDTA溶液与胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合
组织块培养法
(1) 取材、修剪、组织剪或切成1mm3左右的小 块。 (2)将 剪切好的组织小块用眼科镊送入培 养 瓶
内。25ml培养瓶(底面积约为17.5cm2）以20一
30小块为宜。
(3) 放臵2—4h待组织小块贴附后．将培养瓶慢慢
翻转平放、静止培养
注意事项

组织块接种后l-3天，游出细胞数很少,组织块 的粘贴不牢固。观察、移动过程中要注意动作 轻巧。尽量不要引起液体的振荡而产生对组织 块的冲击力使其漂起。 在原代培养的1-2d内要持别注意观察，是否有 细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除， 以防给培养箱内的其它细胞带来污染。 原代培养3-5d需换液一次，去除漂浮的组织块 和残留的血细胞，以免影响原代细胞的生长。
洗手和着装

原则上和外科手术相同。 仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外 线照射30min的清洁工作服

在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着
长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消
毒手。

进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
专用鞋或带鞋套
火焰消毒

细胞培养法方法与步骤
3) 消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放 入无菌试管内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶 液（pH7.4 ～ 7.6），臵37℃水浴中消化20 ～ 40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏 松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管， 加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其 分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布 过滤至另一烧杯中。
胶原酶法（COLLAGENASE）

水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影 响不大。 产品有Ⅳ Ⅶ Ⅸ等型，分别适用于分离肝细胞、 胰岛、脂肪细胞及纤维组织。


钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7
常用剂量为200U/ml
EDTA法



EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合 物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细 胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。 缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时 呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白 酶混合使用(1：1或2：1)，既利于细胞脱壁又 利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。 EDTA工作液的浓度为0.02％，用不含钙、镁 PBS配制。
Βιβλιοθήκη Baidu细胞生物学技术
第三章
细胞培养基本技术
王 云 动脉粥样硬化研究所
细胞培养的优点
活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形 态、结构和生命活动 可控制：

选择特定的细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等 可采用各种研究技术、记录方法
样品均一性：来源于同一组织同一种细胞 经济、规模

局限性

人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和
细胞相互间的影响

体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环 境中，必然发生变化。
本章主要内容
细胞培养的基本操作技术 原代培养(primary culture) 传代培养(subculture) 体外培养细胞的影响因素 细胞培养污染及对策 培养细胞的生长测定方法 细胞冻存和复苏
组织细胞取材及培养的基本要求




取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。 取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量 去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链 霉素和制霉菌素漂洗。 原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的 培养液。 一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低 的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易 培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养 与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标 本，对供体来源、部位及一般情况做记录。
细胞培养法方法与步骤
4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血
细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数后 用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含3 ～ 5×105个细胞为宜。 5)分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培 养瓶 or 培养皿中，盖好，做好标记，臵于37℃ CO2培养箱中培养。 6)观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长 情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传 代培养。
一、细胞培养基本操作技术
由于体外培养的
细胞没有抗感染能力，
因此防污染是决定培 养成功的首要条件。 一切操作需要保证 无菌和有条不紊。
培养前准备

制定好实验计划和操作程序 有关数据的计算要事先做好。
准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置
在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。

避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污
细胞培养法注意事项

取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于
培养液内放臵于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成 1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放臵时间 长或组织块太大都易造成细胞的死亡；

取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液
的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化

细胞培养中的常用术语

组织培养 (Tissue Culture) ： 指的是从体内取 出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并 维持其结构和功能的方法。

器官培养（Organ Culture）： 培养的是器官的 原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生 存、生长和保持一定功能的方法。 细胞培养 (Cell Culture) ： 培养物是单个细胞 和细胞群。
二、原代培养(PRIMARY CULTURE)

从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培 养，即将动物机体的各种组织从机体中取出，
经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用
EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，臵
合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长
和繁殖的过程。
原代培养细胞
组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大 变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体 内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的 很好对象； 原代细胞培养也是建立各种细胞系（cell line)或 细胞株（cell strain）必须经过的阶段。 原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复 杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质 性（heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小 不一


几种细胞的原代培养图示
1.细胞种类：人肺 部 成 纤 维 细 胞 ；2.培养的天数：2D -> 4D -> 7D;3.放大倍数： 200倍 ；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭形， 贴壁生长;
几种细胞的原代培养图示
1. 细胞种类：小鼠胚
胎成纤维细胞 2. 培养的天数：4d；
成功后即为细胞系
细胞培养中的常用术语

细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法 从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标 志的培养物称细胞株。

汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底 物面积。

接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互 接触后失去运动的现象
染机会。
消毒

地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布
要专用)，紫外线照射消毒30-50min

超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然
后紫外线消毒30min。

消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠 放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。

一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架 等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

细胞培养中的常用术语

原代培养（ primary culture ）：从体内取出细 胞或组织的第一次培养。 传代（ passage ）也称再培养。无论是否稀释， 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶 即称为传代或传代培养。也称再培养。


细胞系（ cell line ）：原代培养物经首次传代