喙尾琵甲DNA提取方法比较与AFLP反应体系的建立

AFLP 技术的基本原理与实验方法AFLP 技术的基本原理:AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。

接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。

接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。

选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。

另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。

并与之结合，实现特异性扩增。

实验方法:(1)DNA 酶切AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。

表1：E-M酶切体系表2：P-M酶切体系表3：P-T酶切体系表4：E-T酶切体系表5：M-S酶切体系表6：T-S酶切体系※先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量问题，每次吸取内切酶时一定要注意观察吸取是否足量），将配制好的Mix 加入到模板中，最后在配好的反应体系中加入矿物油覆盖离心，放入PCR仪或水浴锅中37℃条件下5－6小时，然后立即转入65℃条件下1小时完全酶切。

一般做1/2倍体系即可。

目前本实验室拥有的内切酶有：EcoRⅠ；MseⅠ；PstⅠ；TaqⅠ；SacⅠ,以上内切酶均为Fermentas 公司生产。

(2)连接表8：连接体系※在连接的过程中不同的内切酶都有其对应的接头（表7），不同的酶切组合就用相应的接头组合。

遗传标记技术中aflpAFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种遗传标记技术，广泛应用于遗传学研究和种质资源保护。

本文将从AFLP的原理、操作步骤、优势和应用等方面进行介绍。

AFLP是一种基于多态性片段长度的遗传标记技术，它结合了PCR 扩增和限制性内切酶切割的特点。

首先，通过PCR扩增目标DNA 片段，然后利用限制性内切酶对扩增片段进行切割，生成多个DNA 片段。

这些片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离并检测，形成特定的DNA指纹。

通过比较不同个体或群体之间的AFLP指纹图谱，可以揭示出遗传变异的差异。

AFLP的操作步骤相对简单，主要包括DNA提取、PCR扩增、酶切反应、连接DNA适配体、选择性扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

首先，需要从样品中提取高质量的DNA。

随后，利用特定引物对目标DNA进行PCR扩增，产生大量的扩增片段。

接下来，使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切反应，得到多个DNA片段。

这些片段会与连接了适配体的引物结合形成适配体-片段复合物，随后进行选择性扩增，选择性引物将引导特定片段的扩增。

最后，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用荧光染料或放射性同位素进行检测和分析。

AFLP技术具有以下几个优势。

首先，AFLP可以同时检测多个位点的多态性，相比传统的基因标记技术，其检测效率更高。

其次，AFLP技术不需要事先了解目标基因序列，适用于未知基因组的研究。

此外，AFLP可以检测到较低频率的遗传变异，对于研究物种间或个体间的遗传关系非常有用。

最后，AFLP技术具有较高的重复性和稳定性，结果可靠性较高。

AFLP技术在遗传学研究和种质资源保护中得到了广泛应用。

在遗传学研究中，AFLP可以用于揭示物种间或个体间的遗传关系、群体遗传结构的分析以及基因组演化的研究。

在种质资源保护中，AFLP可以用于遗传多样性的评估和遗传资源的鉴定，为保护和合理利用遗传资源提供科学依据。

aflp指纹图谱技术在动物物种鉴定中的应用随着科学技术的发展，新的技术逐渐被引入到动物生物学方面，以改善研究过程。

近年来，AFLP指纹图谱技术（Amplified Fragment Length Polymorphism）被认为是DNA序列分析领域中最有效的工具之一，用于动物物种鉴定和遗传和行为研究。

AFLP指纹图谱技术利用双酶切体系研究AFLP，以协助鉴定和解析动物物种的遗传变异。

AFLP指纹图谱技术首先使用双等位性限制酶切片段（Freci），从物种的DNA中提取多个长度（2-4kb）的片段。

这些片段之后将被扩增并且被AFLP探针锁定，这些AFLP探针是由特定的非模式基因序列组成的。

然后，AFLP指纹图谱被添加到新的DNA序列，以形成AFLP 指纹图谱，该指纹图谱包含物种间的遗传差异。

该技术在动物物种鉴定中有很多好处，它的效率和灵敏度都非常高，而且数据采集和分析要求都比较低。

AFLP指纹图谱技术在动物物种鉴定中有着广泛的应用，它可以用来帮助研究人员了解动物种类的遗传差异，进而推断它们的系统发育关系。

同时，该技术还可以用来进行遗传多样性和进化研究，进行形态改变的研究，以及探测种内遗传变异。

另外，AFLP指纹图谱技术也可以用于动物细胞膜抗原分析，帮助科学家们找到动物细胞膜中具有特异性抗原功能的基因序列，从而改善动物研究和疾病控制。

目前，AFLP指纹图谱技术已经被广泛应用于动物物种鉴定和基因组谱系分析等领域，为动物研究提供了新的视角和工具。

该技术的优势在于它可以快速地收集和探索大量的数据，还可以准确、可靠地分析数据。

但是，AFLP指纹图谱技术也存在一些局限性，比如技术精度较低，耗时较长，容易受到环境因素和外来污染物的影响，鉴定准确性较差。

总之，AFLP指纹图谱技术对动物物种鉴定有着举足轻重的作用，它的应用可以极大地改善动物的研究工作。

此外，AFLP指纹图谱技术还可以改善动物细胞膜抗原分析，从而促进动物的免疫和疾病的治疗。

AFLP 技术的基本原理与实验方法AFLP 技术的基本原理:AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。

接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。

接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。

选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。

另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。

并与之结合，实现特异性扩增。

实验方法:(1)DNA 酶切AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。

表1：E-M酶切体系表2：P-M酶切体系表3：P-T酶切体系表4：E-T酶切体系表5：M-S酶切体系表6：T-S酶切体系※先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量问题，每次吸取内切酶时一定要注意观察吸取是否足量），将配制好的Mix 加入到模板中，最后在配好的反应体系中加入矿物油覆盖离心，放入PCR仪或水浴锅中37℃条件下5－6小时，然后立即转入65℃条件下1小时完全酶切。

一般做1/2倍体系即可。

目前本实验室拥有的内切酶有：EcoRⅠ；MseⅠ；PstⅠ；TaqⅠ；SacⅠ,以上内切酶均为Fermentas 公司生产。

(2)连接表8：连接体系※在连接的过程中不同的内切酶都有其对应的接头（表7），不同的酶切组合就用相应的接头组合。

小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较DNA是生物体的基本遗传物质。

基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。

因此•学习、掌握DNA提取方法并对其迸行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。

国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法［2-7］，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法逬行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法［8-15］。

目前，传统的SDS法和CTAB 法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。

随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多［16-19］。

基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。

本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。

1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料小白鼠购自沈阳医学院实验中心。

1.1.2试剂dNTP 'DNA Marker 高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司‘引物于Invitrogen北京分公司合成» CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。

AFLP(扩增片段长度多态性)分子标记实验扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。

同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。

此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。

其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。

把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA。

二、实验设备1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统，2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3.美国MJ公司PCR仪，4.安玛西亚电泳仪等。

三、实验试剂1. 试剂：请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。

DNA提取试剂盒；EcoRI酶,MseI酶，T4连接酶试剂盒；Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer；AFLP 引物；琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料；超纯水（18.2MΩ·cm）2．其他实验需要物品微量移液枪（一套）及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。

四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。

AFLP实验操作指南AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种基因组DNA的指纹分析技术，通过PCR扩增DNA片段，并利用限制性内切酶消化DNA，然后使用特异引物扩增消化后的DNA片段，最后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物的长度差异，从而得到样品间的遗传多样性信息。

一、实验前准备1.获得研究对象的DNA样品。

2.购买AFLP实验所需的试剂和设备，包括PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA聚合酶、聚丙烯酰胺凝胶电泳设备等。

3.根据实验需要设计合适的引物序列并订购。

二、DNA提取1.根据样品的特点选择合适的DNA提取方法，如CTAB法、酚/氯仿法等。

2.提取的DNA需经过质量检测，确保浓度和纯度。

三、限制性内切酶消化1.根据实验需要选择适当的限制性内切酶，并遵循其使用说明书中的操作要求。

2.准备两个PCR管，一个用于对照组胶样品，另一个用于实验组样品。

3.在每个PCR管中分别加入限制性内切酶、DNA样品、缓冲液和适量的水，混匀后进行酶切反应，酶切时间和温度根据限制性内切酶的要求进行调整。

四、连接接头的制备和连接反应1.根据实验需要设计并合成合适的连接接头，接头一般包括PCR引物序列和一段固定的序列。

2.制备连接反应的混合液，包括连接接头、连接酶、连接缓冲液和适量的水，混匀后加入限制性内切酶消化产物。

3.进行连接反应，反应温度和时间根据连接酶的要求进行调整。

4.连接反应后，可进行酶切反应以去除未连接的连接接头。

五、PCR扩增1.准备两组PCR反应体系，一组为对照组，另一组为实验组。

2.根据实验需要选取合适的扩增引物，对每个引物序列进行扩增反应。

3.准备PCR反应体系，包括PCR引物、扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和适量的水。

4.进行PCR扩增反应，反应温度和周期根据引物的要求进行调整。

5.扩增产物可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，或者通过测量DNA浓度进行定量分析。

第27卷第3期2003年5月　南京林业大学学报(自然科学版)Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition )　Vol.27,No.3　May.,2003　扁桃基因组D NA 的制备和AFL P技术体系的建立Ξ马　艳1,2,马荣才23,徐锡增1(1.南京林业大学,江苏　南京　210037;2.北京农业生物技术研究中心,北京　100089)摘　要:AFL P 技术对DNA 模板的质量要求较高。

桃属果树扁桃的叶片含有较高的糖分、多酚类等物质,基因组DNA 的纯化比较繁琐。

笔者采用3×CTAB 缓冲液提取基因组DNA ,并加以纯化,使DNA 质量达到AFL P 技术的要求。

在AFL P 分析中,筛选出合适的引物组合:采用E +3/M +3选择性引物组合时,扩增条带少;改用E +2/M +3引物组合后,扩增产物主要分布在600～100bp 内,且扩增条带数目适中,多态性适宜,电泳图谱清晰。

关键词:扁桃;DNA 模板;AFL P 分析中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000-2006(2003)03-0035-04D NA T emplate Preparation and the Establishment of AFL PT echnique for Almond CultivarMA Yan 1,2,MA Rong 2cai 23,XU Xi 2Zeng 1(1.Nanjing Forestry University ,Nanjing 210037,China ;2.Beijing AgrobiotechnologyResearch Center ,Beijing 100089,China )Abstract :AFL P analysis needs high quality DNA templates.Almond leaves contain high amounts of polyphenolics and polysaccharides ,and therefore ,the extraction of genomic DNA has been very difficult.In this study ,gemomic DNA was extracted from different cultivar of almond using 3×CTAB extraction buffer and then purified with phenol/chloroform.Restriction analysis and preamplification indicated the DNA sam 2ples were high quality and therefore ,used in the AFL P analysis.Results showed that the E +3/M +3primer combination produced very few bands on genomic DNA of different almond cultivar ,not suitable for the AFL P analysis ,and the E +3/M +3a great number of polymorphic bands in the range of 100～600bp.The establishment of AFL P technique in this work is significant for the analysis of the genetic relatedness of almond species.K ey w ords :Almond ;DNA template ;AFL P analysis普通扁桃(又名巴旦杏,Prunus am ygdal us Stokes 或Prunus dulcis Mill )是世界四大坚果之一,具有重要的经济、营养和保健价值。

喙尾琵琶甲化学成分及药理应用的研究进展贾力扬;李启艳【摘要】喙尾琵琶甲是云南彝族和白族地区民间广泛使用的一种药用昆虫,对多种疑难或常见疾病有一定的疗效,近年对它的研究报道呈现显著增加的趋势.文章归纳近十年内关于喙尾琵琶甲的研究报道,通过对其药材性状、生态分布、化学成分分析、药理作用、应用研究进行综述,以期为这一民族药物能够进一步得到开发利用和更好地为人类服务提供帮助.【期刊名称】《中医药学报》【年(卷),期】2018(046)006【总页数】5页(P118-122)【关键词】喙尾琵琶甲;化学成分;药理作用;研究进展【作者】贾力扬;李启艳【作者单位】昆明理工大学医学院,云南昆明 650504;云南省第一人民医院/ 昆明理工大学附属医院,云南昆明 650032;昆明理工大学医学院,云南昆明 650504;云南省第一人民医院/ 昆明理工大学附属医院,云南昆明 650032【正文语种】中文【中图分类】R285.5喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)是一种在云南地区长期使用的一种传统的药用昆虫，当地的彝族人会将虫体研碎或直接放入口中咀嚼，以此来治疗一些牙周疾病或是缓解牙痛。

这种鞘翅目(Coleoptera)拟步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲属(Blaps)的小甲虫俗称有臭壳子、臭屁虫、高脚虫等很多种，其在民间的作用也十分多，包括抗菌消炎、解毒、提高免疫力，甚至还用来治疗发烧、胃炎、肿瘤等病症[1]。

喙尾琵琶甲在民间应用中表现出巨大的药用价值和开发潜力，本文通过对近十年内关于喙尾琵琶甲的应用研究进行综述，以期使这一传统的药用昆虫能够得到更多的关注和开发利用。

1 药材性状喙尾琵琶甲虫体呈长卵性，通体黑色无光泽。

上唇较平直，具有浓密的棕色毛及不规则的刻点；颏呈椭圆状并且较粗糙有刻点；头部较平坦，有刻点；后颊凸起。

触角呈分结状，长度达到背前胸底部；背部刻点较大且分散，身体分节连接处较粗糙；腹部有明显的皱纹和较稀疏的小粒点；前胸腹部凸起不明显，垂直延展部分不与中胸相连接。

1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。

技术路线：缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。

由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。

单一引物与反向重复序列结合。

使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。

用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离3.AFLP原理：AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。