棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究

VIGS 技术及其在棉花功能基因组研究中的应用进展张景霞1,王芙蓉1,高阳2,张军1*(1.农业部黄淮海棉花遗传改良与栽培生理重点实验室/山东棉花研究中心,济南250100;2.山东师范大学生命科学学院,济南250014)摘要:病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing ,VIGS )是一种转录后基因沉默现象,是植物体内普遍存在的遗传免疫机制,现已被开发为快速、高效、高通量的反向遗传学技术,在植物基因功能研究中得到广泛应用。

近年,利用VIGS 技术进行棉花基因功能研究也取得了一定进展。

本文对VIGS 技术的发展、操作技术的优化进行了综述,尤其总结了VIGS 技术在棉花抗病、品质改良、生长发育等基因鉴定和功能研究中的应用进展,并对其应用前景进行了展望。

关键词:棉花;VIGS ;基因功能;抗病基因;品质基因中图分类号:S562.035文献标志码:A文章编号:1002-7807(2015)05-0469-0510.11963/issn.1002-7807.201505011Zhang Jingxia 1,Wang Furong 1,Gao Yang 2,Zhang Jun 1*(1.250100,;2.250014,)Virus-induced gene silencing (VIGS)is a kind of post-transcriptional gene silencing that is common in plants and hasbeen widely applied to study gene functions as a reverse genetics technique because of its rapidity,high efficiency and through-put characteristics.In recent years,VIGS has been used in the research of gene functions in cotton.This paper reviews the prin-ciples of the VIGS technology system in cotton,especially summarizing the applications of VIGS in the identification and func-tional research of genes related to disease resistance,fiber quality,and development.Finally,the applications of VIGS in cotton research are discussed.cotton;VIGS;gene function;disease resistance gene;quality gene收稿日期:2014-12-02作者简介:张景霞(1983―),女,博士,助理研究员,jxzhang1983@ ;*通信作者,scrczj@基金项目:国家科技重大专项“转基因生物新品种培育”(2014ZX0800501B-003);棉花生物学国家重点实验室开放课题(CB2013A25)二倍体棉种雷蒙德氏棉()、亚洲棉()全基因组测序相继完成[1-2],产生了大量的DNA 序列信息,为棉花产量、品质和抗性改良奠定了基础。

棉花组织培养过程中外植体所需的激素浓度及配比的研究摘要：本文研究了以下胚轴为外植体材料的棉花组织培养过程中，愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎（胚状体）的诱导所需要的最佳激素浓度及配比。

研究结果表明：以上三个诱导过程所需要的最佳激素浓度及配比分别为IAA 、KT（激动素）、2,4-D 各0.1 mg/L或者ZT（玉米素）0.1 mg/L、0.05mg/L IAA +0.1 mg/L KT 或者0.1 mg/L ZT、不加入任何种类的激素或者尽量加入低浓度的激素。

关键词：棉花；下胚轴；胚性愈伤组织（EC）；胚状体1引言激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用，它可以严重影响棉花愈伤组织诱导、分化及体细胞胚胎发生等一系列过程。

王清连等[1]研究发现，激素的浓度及不同种类激素的搭配是影响棉花外植体诱导获得胚性愈伤组织和胚状体的主要因素之一[2-3]。

因此，本文就以下胚轴为外植体材料的棉花组织培养过程中愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎（胚状体）的诱导所需要的最佳激素浓度及配比进行了一系列的讨论。

2材料和方法2.1材料棉花品种为“珂字棉312”，由上海交通大学农业与生物学院左开井博士提供。

2.2研究方法2.2.1愈伤组织诱导的最佳激素浓度及配比选取生长状况相同的棉花无菌苗下胚轴，分成九份，分别接种到含有1.对照（不添加任何激素）、2.KT（激动素）0.1 mg/L、3.IAA 0.1 mg/L、4.2,4-D 0.1 mg/L、5.ZT（玉米素）0.1 mg/L 、6.IAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L、7.IAA 0.1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L、8.KT 0.1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L、9.IAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L的九种不同的愈伤组织诱导培养基上。

每隔3周左右对培养基继代一次。

约2个月后，分别统计各培养基上下胚轴的出愈率情况，并记录（数字1-10分别为图1对应的横坐标）。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2024, 50(5): 1172 1180 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************本研究由国家自然科学基金项目(32172025)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32172025).*通信作者(Corresponding author): 林忠旭,E-mail:********************第一作者联系方式:E-mail:*****************Received (收稿日期): 2023-10-16; Accepted (接受日期): 2024-01-12; Published online (网络出版日期): 2024-02-07. URL: https:///urlid/11.1809.S.20240205.1152.008This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (/licenses/by-nc-nd/4.0/).DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.34167陆地棉重组自交系再生能力和遗传转化效率筛选乐 愉 王 涛 张献龙 林忠旭*华中农业大学植物科学技术学院 / 作物遗传改良全国重点实验室, 湖北武汉 430070摘 要: 转基因工程育种是棉花种质创新的有效手段, 为了拓展陆地棉可再生基因型, 丰富棉花转基因受体, 本研究以湖北省高产阔叶棉品种‘鄂棉22’ (E22)为母本、高再生能力的鸡脚叶品种‘豫早1号’ (YZ1)为父本, 通过单籽传法构建了F 9重组自交系群体(YE); 利用棉花中比较成熟的IBA+KT (IK)和2,4-D+KT (DK) 2种不同激素组合的培养体系, 分别对重组自交系群体的164个家系的愈伤组织诱导率(CIF)、愈伤组织继代繁殖力(CSC)、愈伤组织的出胚率(CRE)以及愈伤组织出胚时间(CET)进行比较, 共获得12个可再生的阔叶棉家系; 利用目前成熟的棉花遗传转化体系对可再生阔叶棉家系进行遗传转化效率分析, 同时对其进行田间农艺性状考察, 最终获得了一个遗传转化效率为82.9%并且农艺性状更优良的家系YE3。

山西农业科学２００６，３４（１）：２９～３１Ｊｏ“ｒ，ｌ口￡ｏ，Ｓ矗口，２ｚｉＡｇｒ缸“￡ｆ“，‘口Ｚ！站如ｎｃ酣不同棉花愈伤组织状态与胚胎发生及其植株再生的关系李官德１，肖娟丽２，罗晓丽２，张安红２，吴家和２（１．山西运城农业职业技术学院，山西运城０４４０００；２．山西省农业科学院棉花研究所，山西运城０４４０００）摘要：研究结果表明，能够分化出体细胞胚胎并再生成植株的４种愈伤组织状态为：直接产生胚性愈伤组织或体细胞胚胎簇状胚状体、淡黄色且疏松结构胚性愈伤组织、颗粒状疏松结构愈伤组织及褐化、生长缓慢的愈伤组织；难以分化出体细胞胚胎的４种愈伤组织状态为：易发生体细胞胚再愈伤化的愈伤组织、翠绿色表面有硬块状的愈伤组织、易诱导出胚性愈伤组织但不分化成苗的胚性愈伤组织、疯长型愈伤组织。

关键词：棉花；组织培养；愈伤组织；胚胎发生；再生植株中图分类号：ｓ５６２．０３５．３文献标识码：Ａ文章编号：１００２—２４８ｌ（２００６）０１—００２９—０３ＳＯｍａｔｉｃＥｍｂｒｙＯｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＰｌａｎｔＲｅｇｅｎｅｒａｔｉＯｎＯｆＣａＵｉＤｅｒｉＶｅｄｆｒＯｍＣｏｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓ）伊ｌＨｍ矗Ｚ，ｓＨｆ“ｍＬ）ＤｅｐｅｎｄｉｎｇｏｎＴｈｅｉｒＱｕａｌｉｔｙＬＩＧｕａｎ—ｄｅｌ，ＸＩＡＯＪｕａｎ—ｌｉ２，ＬＵＯＸｉａｏ—ｌｉ２，ＺＨＡＮＧＡｎ—ｈｏｎ９２，ＷＵＪｉａ—ｈｅ２（１．颤ｒ打“如“ｍｆ＆艘ｒ阮矗起（蛔到＆＾蒯抽ｈ恕旃Ｐ咒ｇ－ｈ九幽彻ｇ０４４０００－吼ｉ挖日；２．ｆ雄盯打Ｍ把∥ＣＤ，加以Ｒ西觚ｒ曲，懿ｎ舭ｉＡ彻妇研ｙ∥Ａ∥ｉｃ“如“ｒ口Ｚ＆ｉ跏卯。

ｈｎ如Ｐ，ｚｇ０４４０００．吼ｉ理口）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅａｒｅｆｏｕｒｔｙｐｅｓｏｆｃａｌｌｉｗｈｉｃｈｏｗｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＳｏｍａｔｉｃｅｍ－ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ。

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第二十四章综合测试一、单选题1.下面属于转基因技术成果的是（）A.抗虫棉B.太空椒C.白脸“多莉”D.袁隆平超级稻2.20世纪90年代，我国科学家通过转基因技术将细菌的抗虫基因成功地转移到棉花的受精卵中，培育出抗虫效果明显的棉花新品种。

以上事实说明（）A.细胞中的基因具有显性与隐性之分B.生物的性状由基因控制C.基因存在于染色体上D.细胞中的基因是成对存在的3.关于克隆羊多利的叙述，错误的是（）A.克隆技术属于无性繁殖B.克隆羊多莉的诞生能说明细胞核是遗传的控制中心C.利用克隆技术可以快速繁殖具有优良品质家畜D.多莉遗传了代孕母羊一半的遗传信息4.在克隆羊多莉的培育过程中，从甲羊的乳腺细胞中取出细胞核，移入乙羊的去核卵细胞中培养成早期胚胎，再移入丙羊的子宫内，由丙羊孕育并生下了“多莉”。

多莉的相貌与哪只羊相似A.甲B.乙C.丙D.都相似5.我国科学家培育成的抗棉铃虫的转基因抗虫棉，其抗虫基因来源于（）A.普通棉的突变基因B.棉铃虫变异形成的致死基因C.棉铃虫体内的寄生虫的基因D.苏云金杆菌的抗虫基因6.不需要精子与卵细胞的结合，而是直接由一个动物体细胞，利用现代生物技术培育出与亲代一模一样的动物后代，这个过程是（）A.胎生B.动物克隆C.体内受精D.体外受精7.人类广泛应用遗传变异原理培育新品种，下列有关常见的育种方法描述错误的是（ ）A.高产奶牛是通过人工选择的方法培育出来B.能合成人胰岛素的大肠杆菌是利用克隆技术培育出来的C.高产抗倒伏小麦是利用杂交方法培育的新品种D.太空椒是普通椒经诱导发生基因突变选育的新品种8.如果发现一个完好恐龙细胞，可用下列哪种方法培育出恐龙（）A.转基因技术 B.克隆技术 C.发酵技术 D.酶工程的的9.我国科学家童第周教授曾用黑斑蛙做实验。

黑斑蛙的红细胞很不活跃，不但不分裂，而且代谢活动也很微弱。

但是，将其细胞的核移植到了黑斑蛙的去核卵中，这个原来不活跃的细胞核在改换了的细胞质中又开始分裂，而这个换了核的卵也能发育成蝌蚪。

植物体细胞胚发生及发育研究进展摘要：体细胞胚发生是植物界的一个普遍现象，具有广阔的应用前景和巨大的潜在经济价值。

近几年来，对植物体细胞胚胎发生的研究取得了较大的进展，但同时也存在着一系列的问题有待于进一步解决。

根据近几年来的相关研究报道，本文综述了影响体细胞胚发生和发育的外部条件，如植物激素、光质、碳源、活性炭、渗透压、培养条件等；内部因素如基因型、生理状态。

以期为植物体细胞胚诱导提供一定参考价值。

关键词：体细胞胚发生；植物激素；内因；外因The Advance ofPlantSomaticEmbryogenesisand DevelopmentLiming，Wangshuxiang，Fengdaling(Collegeo~LifeScience,AgricultureUniversityofHebei,BaodingHebei071001)Abstract：Plant somatic embryogenesis is a common phenomenon and has wide application prospects and potentialeconomic value．Greatprogress has been made in plantsomatic embryogenesis recently，butmanyproblems are stilunsolved．Based on therelated reports and literature ofrecentyears．the research resultson factorsaffecting ofplantsomatic embryogenesiswere summarized．Itis including outerfactors，such as plant hormones，light quality，carbon source，osmotic pressure and culture conditions；interior factors，such as genotypeand physiologicalstate．Thiscan providereferencesfortheresearcheson somatic embryo induction．Key words：somaticembryogenesis；planthormones；interiorfactors；outerfactors引言植物组织培养中体细胞胚的发生不仅具有普遍性，而且具有数量多，速度快，结构完整的特点。

棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察曹景林, 张献龙*, 杨细燕, 邓锋林，谭家福，郝娟(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070)摘要：以陆地棉品种Coker 201下胚轴为外植体诱导愈伤组织，并以介于30-50目筛之间的胚性愈伤细胞团为材料进行单个细胞团培养，采用石蜡切片法观察棉花愈伤组织诱导和分化过程及体细胞胚发生和发育过程。

结果显示棉花胚性愈伤组织有下胚轴两端发生、内发生、非胚性细胞转化、外发生和腺体处发生5种形成途径，其中两端发生和内发生是主要的形成方式；棉花体细胞胚存在单细胞起源，多为表面发生。

棉花体细胞胚发育过程中最关键的事件似乎是极性的建立、顶端分生组织的形成以及前形成层的分化和生长轴变化。

球形胚时期表皮原层的分化标志着体细胞胚结构分化的开始。

初始前形成层的形成是体细胞胚形态转变的第一个信号。

球形胚内部等径细胞轴向延长，接着前形成层生长轴发生变化，这些是心形胚或椭圆形体胚中的重要事件。

鱼雷形胚基本分生组织中液泡的出现开始了组织分化的过程。

对一些停滞发育的球形胚和鱼雷形胚的解剖检查表明，极性建立可能是决定体细胞胚能否萌发的关键因素。

关键词：棉花；体细胞胚胎发生；组织细胞学基金项目：教育部新世纪人才支持计划(NCET-04-0740)作者简介：曹景林（1967-），男，博士，遗传育种专业，现在湖北省烟草科研所工作。

*通讯作者（Corresponding author）:张献龙，男，教授，博士生导师。

E-mail:xlzhang@Histo-cytological Observation of Somatic Embryogenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.)Cao Jing-lin, Zhang Xian-long, Y ang Xi-yan, Deng Feng-lin, Tan Jia-fu, Hao Juan (National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, 430070, Wuhan,Hubei, China)Abstract：Calli were induced from hypocotyl explants of cotton cultivar Coker 201, and individual embryogenic cell clusters with 30–50 mesh sieve, which isolated from embryogenic suspension cultures, were cultured. The development of the calli and single few-celled aggregates was observed through paraffin sections. The results revealed 5 pathways of embryogenic calli origination including origination from both ends of hypocotyls, origination in inner, differentiation from non-embryonic cells, origination from outer cells of calli, and origination in the surrounding of gland. Among these, the origination from both ends of hypocotyls and in inner were the most important pathways. Cotton somatic embryos originated from individual embryogenic cells, which were in exterior of embryogenic calli in most cases. The most critical events appeared to be the establishment of apical-basal patterns of symmetry, formation of apical meristems, and differentiation and axial change of procambium during the development of cotton somatic embryos. Differentiation of the protoderm layer marked the beginning of the structural differentiation in globular stage. Incipient procambium formation was the first sign of somatic embryo transition. Axial elongation of inner isodiametric cells of the globular somatic embryo followed by the change in the growth axis of the procambium was an important event in heart-shaped or oblong-stage somatic embryo. Vacuolation in the ground meristem of torpedo-stage embryo began the process of histodifferentiation. Histological observations of some globular and torpedo-shaped embryos which faired to advance showed that establishment of polarity was the key factor which determined germination of somatic embryos.Keywords: Cotton; Somatic embryogenesis; histo-cytology体细胞胚胎发生是指与原始组织不存在微管束联系的非合子细胞发育成一个类似合子胚的极性结构的过程[1,2]，它经历了与合子胚发生类似的关键阶段：球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶成熟胚[1]。