ssc-miR-148a启动子克隆及其特征分析

分子生物学论文如何克隆哺乳动物免疫基因的上游区启动子，并验证其中的调控元件？实验原因：随着气候变化，环境污染，水污染，放射性污染，重金属污染，生态系统遭到破坏，在这个疾病泛滥的时代，我们每个人、哺乳动物都不能避免生病这件事情，而对于某些恶性疾病，对我们来说是致命的，如果我们能够掌握免疫启动上的技术，那么我们就可以按照我们的意愿及时对免疫基因的启动子进行调控，使得我们可以及时预防恶性疾病的侵袭，避免一定的经济损失，在体内合成大量的抗体，当病毒分子来袭时我们可以做好准备工作，对于养殖业来说可以大大降低生产时候药物资金的投入，同时使得我们的供应品更让人放心，同时对于人类来说，减少疾病的折磨，人和动物传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病和变态反应性疾病进行诊断，是免疫技术最突出的应用。

尤其是酶标抗体技术，已成为多种传染病的常规诊断方法，如已有人各型肝炎、猪瘟等ELISA试剂盒，它们简便、快速，又具有高度的敏感性和可重复性。

此外，免疫基因在疾病诊断、动物生理活动研究、物种及微生物鉴定、动物性状的免疫标记等方面有极其重要的应用，所以对哺乳动物免疫基因上游区启动子的研究是很有必要很有意义的一件事情。

实验方法：启动子（promoter）是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。

启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。

在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。

完全的启动子称为规范序列。

在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游-25~-30 bp处的共同序列似TAAA，也称为TATA区。

另外，在起始位点上游-70～-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列．称为CAAT区（CAAT hox）。

麦类作物学报 2021,41(12):1452-1458J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o ps d o i :10.7606/j.i s s n .1009-1041.2021.12.02网络出版时间:2021-12-07网络出版地址:h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /61.1359.S .20211207.0849.002.h t m l 小麦m i R N A 启动子的基因组分析收稿日期:2021-02-23 修回日期:2021-05-03基金项目:国家自然科学基金项目(31971831)第一作者E -m a i l :642207059@q q.c o m 通讯作者:苍晶(E -m a i l :c a n g j i n g2003@163.c o m )任治鹏,王多佳,田宇,娄贵成,李畅,王政委,张达,苍晶(东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)摘 要:M i c r o R N A (m i R N A )是一类非编码R N A ,与植物的生长发育及胁迫响应密切相关㊂为给小麦m i R N A 的转录调控以及新m i R N A 的预测提供参考依据,本研究通过小麦m i R N A 基因定位㊁启动子预测以及顺式作用元件鉴定等方法对小麦m i R N A 启动子进行了基因组分析,结果表明,小麦基因组中有105个pr e -m i R N A 位于150个基因座上,大部分为单拷贝㊂148个m i R N A 基因座具有潜在启动子区域,其中115个m i R N A 基因至少能够预测到一个启动子㊂保守性及基因位置不同的m i R N A 的启动子转录起始位点(T S S)分布也稍有不同,但大多数位于上游序列近端区域㊂对m i R N A 基因T S S 上游序列的顺式作用元件分析发现,m i R N A 启动子区域存在与胁迫响应相关的基序,且小麦中存在3个m i R N A 启动子特异性基序㊂61.4%的小麦m i R N A 启动子区域有C pG 岛分布㊂关键词:小麦;m i R N A ;启动子;顺式作用元件;基因组中图分类号:S 512.1;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2021)12-1452-07G e n o m i cA n a l ys i s o fW h e a tM i c r o R N AP r o m o t e r s R E NZ h i p e n g ,W A N GD u o j i a ,T I A NY u ,L O UG u i c h e n g,L IC h a n g ,W A N GZ h e n g w e i ,Z H A N GD a ,C A N GJ i n g(C o l l e g e o fL i f eS c i e n c e ,N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,H a r b i n ,H e i l o n g j i a n g 150030,C h i n a )A b s t r a c t :M i c r o R N A s (m i R N A s )a r e s h o r t n o n -c o d i n g R N A s a n d p l a y i m po r t a n t r o l e s i n p l a n t d e v e l -o p m e n t a n d s t r e s s r e s p o n s e .I no r d e r t o p r o v i d e r e f e r e n c e s f o r t h e t r a n s c r i p t i o n a l r e gu l a t i o no fw h e a t m i R N Aa n d t h e p r e d i c t i o no fn e w m i R N A.I nt h i ss t u d y ,t h e g e n o m i cc h a r a c t e r so fw h e a tm i R N A p r o m o t e r sw e r e a n a l y z e db y t h em e t h o d s o fw h e a tm i R N A g e n e l o c a t i o n ,pr o m o t e r p r e d i c t i o n ,a n d i -d e n t i f i c a t i o no f s p e c i f i c c i s -a c t i n g el e m e n t s .I n t h ew h e a t g e n o m e ,a t o t a l o f 105p r e -m i R N A w e r e l o -c a t e do n150g e n e l o c i ,m o s t o fw h i c hh a ds i n g l ec o p y .A m o n g th e150l o c i ,148m i R N A g e n e sh a d p o t e n t i a l p r o m o t e r s ,o fw h i c h115m i R N A g e n e sw e r e p r e d i c t e d t oh a v ea t l e a s t o n e p r o m o t e r .T h e p r o m o t e r c h a r a c t e r i s t i ca n a l y s i so fd i f f e r e n tt y p e so f m i R N A s (i n t e r ge n i cv e r s u si n t r o n i ca n dc o n -s e r v e dv e r s u sn o n -c o n s e r v e d p r e -m i R N A s )r e v e a l e dt h a t t h ed i s t r i b u t i o nof t r a n s c r i pt i o ns t a r ts i t e s (T S S s )w a s s l i g h t l y d i f f e r e n t ,a n dm o s t o fT S S sw e r e l o c a t e d i n t h e p r o x i m a l r e g i o no f t h e u ps t r e a m s e q u e n c e ,w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h e p r o x i m a l p r o m o t e r r e g i o nm a y p l a y am o r e e f f e c t i v e r o l e i nm i R N A t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n .I na d d i t i o n ,t h e s t a t i s t i c so f c i s -a c t i n g e l e m e n t so n t h eu p s t r e a ms e qu e n c eo f m i R N A T S S s s h o w e d t h a tm i R N A p r o m o t e r r e g i o n s h a d f u n c t i o n a lm o t i f s r e l a t e d t o s t r e s s r e s p o n s e ,a n d t h e r ew e r e t h r e em i R N A p r o m o t e r -s p e c i f i cm o t i f s i nw h e a t .M o r e o v e r ,t h r o u gh t h e i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o fC p Gi s l a n d s ,w e f o u n d t h a t 61.4%o f t h em i R N A p r o m o t e r r e g i o n so fw h e a t c o n t a i nC pG i s l a n d s .K e y w o r d s:W h e a t;m i R N A;P r o m o t e r;C i s-a c t i n g e l e m e n t;G e n o m eM i c r o R N A(m i R N A)是一类长度为21~24 n t的非编码R N A,广泛存在于植物中,通过负调控其靶基因,参与调控植物的生长发育和逆境胁迫响应[1-2]㊂m i R N A的生物合成过程主要包括m i R N A基因的转录㊁初始转录本加工为成熟m i R N A以及成熟m i R N A装载形成R N A诱导的沉默复合体(R N A-i n d u c e ds i l e n c i n g c o m p l e x, R I S C)[3-7]㊂R I S C通过酶切降解靶基因m R N A 或者抑制靶基因m R N A的翻译,从而对靶基因进行转录后水平上的调控[8]㊂在植物中,能够转录形成m i R N A的m i R N A 基因大部分位于基因间隔区,作为独立的转录单位,只有部分m i R N A基因位于蛋白质编码基因内,能与宿主基因共同转录[9]㊂研究表明,m i R-N A基因由R N A聚合酶Ⅱ(R N A p o l y m e r a s e Ⅱ,P o lⅡ)转录[10]㊂P o lⅡ型启动子包括核心启动子区和上游作用元件,核心启动子区主要由T A T A-b o x㊁转录起始位点(t r a n s c r i p t i o ns t a r t s i t e,T S S)等构成[11]㊂了解m i R N A基因的位置㊁启动子的T S S㊁特定顺式作用元件等上游序列特征,对于研究m i R N A的表达模式及m i R N A介导的调控网络具有重要意义[12]㊂近年来,通过生物信息学分析结合高通量测序,对植物m i R N A 基因的启动子开展了一定的研究㊂如在拟南芥中,M e g r a w等[13]和X i e等[14]通过5'-R A C E的方法,发现大部分拟南芥m i R N A启动子包含T A T A-b o x㊂Z h o u等[15]通过C o V o t e的方法,在拟南芥㊁水稻等植物中鉴定了基因间m i R N A基因的启动子,结果表明,m i R N A基因与蛋白质编码基因均由P o lⅡ型启动子启动,并具有特定的上游元件㊂Z h a o等[16]利用c D N A数据对水稻和拟南芥两种植物m i R N A启动子元件进行比较,同时通过C h I P方法对拟南芥m i R N A基因的T S S进行了预测[17]㊂随着植物基因组研究的发展,促进了m i R N A启动子的鉴定和研究㊂如C u i 等[18]通过基因组数据,定位了水稻m i R N A前体(m i R N A p r e c u r s o r,p r e-m i R N A)在染色体上的位置,并通过T S S P软件预测了m i R N A基因的T S S㊁T A T A-b o x等核心启动子区㊂L i u等[19]和H a n等[20]利用大豆基因组数据对m i R N A基因的启动子特征进行了相关分析㊂K a n j a n a w a t t a n-a w o n g[21]等发现,橡胶树中对乙烯响应的m i R-N A启动子具有多种植物激素相关作用元件㊂Z h o u等[22]利用T S S P-T C M软件对拟南芥㊁毛果杨㊁水稻㊁高粱4种植物的m i R N A启动子进行生物信息学分析,发现基因间和基因内以及保守和非保守m i R N A的启动子具有不同的基因组分布特征及特异性作用元件㊂此外,研究者在拟南芥[23]㊁水稻[24]m i R N A启动子中也发现具有与胁迫相关的特异性转录因子结合元件㊂六倍体(2n=6x=42,A A B B D D)普通小麦(T r i t i c u ma e s t i v u m L.)是全球种植最广泛的农作物之一,为人类提供了20%的消耗能量[25]㊂目前,对小麦m i R N A的研究主要集中于克隆鉴定㊁表达特征分析以及通过预测靶基因进行功能研究等方面[25-26],然而关于小麦m i R N A启动子的研究报道较少㊂近年来,国际小麦基因组测序联盟(I n t e r n a t i o n a l W h e a tG e n o m eS e q u e n c i n g C o n-s o r t i u m,I WG S C)对中国春小麦基因组的组装工作已经完成,其公布的小麦全基因组序列信息对于小麦m i R N A启动子的分析研究具有极大的促进作用㊂本研究通过生物信息学方法对m i R N A 基因组位置分布㊁m i R N A启动子预测以及顺式作用元件的富集和特异性进行研究,以期在基因组水平对小麦m i R N A启动子有一个较为全面的了解,为小麦m i R N A的转录调控探究以及新m i R N A的预测提供依据㊂1材料与方法1.1小麦m i R N A基因位置的预测所有的小麦m i R N A序列来源于m i R B a s e数据库(R e l e a s e22.1,h t t p://w w w.m i r b a s e. o r g/)[27]㊂从E n s e m b lP l a n t s(f t p://f t p.e n s e m-b l g e n o m e s.o r g/p u b/p l a n t s/r e l e a s e-48/f a s t a/ t r i t i c u m_a e s t i v u m/d n a/)下载中国春小麦基因组序列信息㊂使用U R G IB L A S T(h t t p s://u r g i. v e r s a i l l e s.i n r a e.f r/b l a s t/?d b g r o u p=w h e a t_ i w g s c_r e f s e q_v2_c h r o m o s o m e s&p r o g r a m= b l a s t n)[28]进行小麦p r e-m i R N A的基因组定位,选择i d e n t i t i e s=100%的b l a s t结果作为m i R N A 基因的位置,对于i d e n t i t i e sʂ100%的m i R N A则将i d e n t i t i e sȡ97%且m i s m a t c h e sɤ2的结果作为m i R N A基因的位置[19]㊂预测的m i R N A基因通过M a p c h a r t2.30[29]软件进行小麦染色体图谱㊃3541㊃第12期任治鹏等:小麦m i R N A启动子的基因组分析的绘制㊂所有能够定位于小麦基因组上的m i R-N A基因根据两种方法进行分类,第一种分类方法是根据m i R N A保守性分为保守和非保守m i R N A基因,鉴定方法如下:首先利用m i R B a s e 提供的所有物种p r e-m i R N A序列建立本地b l a s t 库,然后将所有小麦p r e-m i R N A进行本地b l a s t 比对㊂如果其他植物中存在i d e n t i t i e s>85%且a l i g n m e n t l e n g t h>90%的相似序列[22],则该基因为小麦保守m i R N A基因,否则为非保守性m i R-N A基因㊂第二种分类方法则根据m i R N A基因在染色体上的位置进行分类,通过J B r o w s e(h t-t p s://u r g i.v e r s a i l l e s.i n r a.f r/j b r o w s e i w g s c/ g m o d_j b r o w s e/)[30]判断m i R N A基因的分布情况,将m i R N A基因分为基因间和基因内两种类型㊂基因间m i R N A位于蛋白质编码基因之间,而基因内m i R N A序列位置则与蛋白质编码基因重叠[15]㊂判断m i R N A基因染色体位置参考的编码蛋白质基因数据为I WG S C中国春A n n o t a-t i o nv1.1数据库[31],包括可高信度(H C)和低信度(L C)蛋白质编码基因座㊂1.2小麦m i R N A基因启动子的预测首先通过Z h o u等[15]的方法获得p r e-m i R-N A的基因间5'端上游序列,当p r e-m i R N A与上游蛋白质编码基因转录方向相同时,如果它们之间的距离大于2400b p,则检索p r e-m i R N A上游2000b p序列;如果距离小于2400b p,则检索上游蛋白质编码基因下游400b p与p r e-m i R N A之间的序列㊂当p r e-m i R N A及其上游蛋白质编码基因转录方向相反时,如果它们之间的距离大于4000b p,则获取p r e-m i R N A上游的2000b p序列,如果距离小于4000b p,则检索从p r e-m i R-N A到中间点(上游蛋白质编码基因与p r e-m i R-N A之间)的序列㊂将以上方法获得的序列作为潜在的启动子预测区域,利用T S S P(h t t p:// w w w.s o f t b e r r y.c o m)进行小麦m i R N A启动子及T S S的预测㊂1.3小麦m i R N A基因启动子上游顺式作用元件的分析利用P l a n t C A R E数据库(h t t p://b i o i n f o r-m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t-m l/)[32]对m i R N A启动子T S S到上游2000b p 序列中的顺式作用元件进行分析㊂对于有多个启动子的m i R N A基因,为获得尽可能多的顺式作用元件信息,选择距离p r e-m i R N A起始位点最近的T S S进行分析㊂为了进一步研究m i R N A启动子区域基序的特异性,通过M E M E(h t t p s:// m e m e-s u i t e.o r g/m e m e//t o o l s/m e m e)[33]对m i R N A启动子上游序列中长度为10b p的基序进行鉴定,选择结果中前20个基序进行分析,其他设定为默认值㊂利用全基因组蒙特卡罗模拟方法获得基序的Z-s c o r e,从而判断各基序在小麦m i R N A启动子的特异性[15],具体方法如下:首先将所有获得的m i R N A启动子序列作为目标集,然后在小麦基因组上随机选择长度为2000b p 的序列作为参考集,参考集与目标集的序列数目相同;通过F I MO(h t t p s://m e m e-s u i t e.o r g/ m e m e//t o o l s/f i m o)统计特定基序在目标集和参考集m i R N A序列上平均数量,分别记为N t和N r㊂Z-s c o r e的计算公式为Z=(N t/N r)=σ,它能测量目标集中的基序平均出现次数与参考集样本的均值之间的归一化差异[22]㊂利用C p G P l o t (h t t p://e m b o s s.b i o i n f o r m a t i c s.n l/c g i-b i n/e m-b o s s/c p g p l o t)对小麦m i R N A T S S上游序列中的C p G岛进行分析㊂2结果与分析2.1小麦m i R N A基因的染色体定位目前为止,m i R B a s e数据库(R e l e a s e22.1)共收录122个小麦p r e-m i R N A序列㊂小麦p r e-m i R N A序列和中国春基因组序列b l a s t结果表明,105个(86.1%)p r e-m i R N A定位于小麦染色体上的150个基因座上,而其余17个(13.9%) p r e-m i R N A位于未知染色体或基因组的基因座上,下文中不对此类p r e-m i R N A进行统计㊂p r e-m i R N A分布在小麦所有42条染色体上,其中A 组染色体上有54个,B染色体上有56个,而D组染色体上有40个,93个(76.2%)p r e-m i R N A在染色体上只有1个拷贝,含有2个和2个以上拷贝的p r e-m i R N A分别有4和8个,共占比9.84%,其他17个p r e-m i R N A的拷贝为0㊂2.2小麦m i R N A基因的启动子预测结果150个小麦m i R N A基因座中有148个能够获得启动子潜在区域,对148个m i R N A基因座5 上游序列进行启动子预测,由于部分m i R N A 基因座能够预测到多个启动子,因此共获得166个m i R N A潜在启动子㊂115个(77.7%)小麦p r e-m i R N A基因能够预测到一个启动子,其中, 69个基因的上游序列只能预测到一个启动子,而㊃4541㊃麦类作物学报第41卷其他基因具有多个启动子㊂T S S 是重要的启动子核心元件,对小麦m i R -N A 基因T S S 位点与p r e -m i R N A 距离分布进行统计分析,发现大部分小麦m i R N A 基因的T S S 分布在上游0.8k b 区域内以及1.0~1.6k b 区域内,占全部启动子T S S 数的81.9%(0~0.8k b :54.2%,1.0~1.6k b :27.7%)㊂在所有上游区域中,小麦m i R N A 基因的T S S 在上游0.2k b区域内分布最多(24.1%),而在上游0.8~1.0k b 区域分布较少(5.4%)㊂根据m i R N A 在基因组的位置不同,可分为基因间m i R N A 和基因内m i R N A ,从图1A 可以看出,两种m i R N A 的T S S 均在基因上游0.2k b 区域内分布较多,不同的是基因内m i R N A 在上游0.2~0.4k b ㊁0.6~0.8k b ㊁1.4~1.6k b 间也具有较多的T S S 分布,而基因间m i R N A 在这几个区域内无明显的分布特殊性㊂根据m i R N A 的保守性,可分为保守性m i R N A 和非保守性m i R -N A ,从图1B 可以看出,两种m i R N A 的T S S 均在基因上游0.2k b 区域内分布最多,而与非保守m i R N A 相比,保守m i R N A 在上游1.4~1.6k b 区域内也具有较多分布㊂A :基因间和基因内m i R N A T S S 的分布百分比;B :非保守和保守m i R N A T S S 的分布百分比㊂A :P e r c e n t a g e o fT S Sd i s t r i b u t i o no f i n t e r g e n i c a n d i n t r a g e n i cm i R N A g e n e s ;B :P e r c e n t a geo fT S Sd i s t r i b u t i o no f n o n -c o n s e r v a t i v e a n d c o n s e r v a t i v em i R N A g e n e s .图1 不同种类m i R N A 的T S S 分布F i g .1 T S Sd i s t r i b u t i o no f d i f f e r e n t t y pe s o fm i R N A 2.3 小麦m i R N A 基因启动子上游的特异性顺式作用元件利用P l a n t C A R E 对所有m i R N A 基因T S S 上游2000b p 序列进行顺式作用元件分析,结果(图2)表明,m i R N A 启动子区域中含有的三种顺式作用元件较多,分别为C A A T -b o x ㊁T A T A -b o x和U n n a m e d _4㊂此外与A B A 响应相关的元件(A B R E )㊁与M e J A 响应相关的元件(T G A C G -m o t i f ㊁C G T C A -m o t i f 和MY C )㊁与光响应相关的元件(G -b o x )以及与多种胁迫和代谢调控相关的元件(MY B )在小麦m i R N A 基因上游的占比也较高㊂㊃5541㊃第12期任治鹏等:小麦m i R N A 启动子的基因组分析图中数据为启动子上游顺式作用元件所占百分比㊂V a l u e s i n t h e f i g u r e i s t h e p e r c e n t a g e o fm i R N A p r o m o t e r c i s-a c t i n g e l e m e n t s.图2T S S上游顺式作用元件的分布F i g.2P e r c e n t a g e o f c i s-a c t i n g e l e m e n t s i nu p s t r e a ms e q u e n c e s o fT S S s为进一步鉴定小麦m i R N A基因启动子上的基序特异性,通过M E M E获得在T S S上游序列出现频率较高的且长度为10b p的基序,然后利用全基因组的蒙特卡罗模拟计算获得基序的Z-s c o r e㊂Z-s c o r e的大小在一定程度上能反应基序在m i R N A启动子上的特异性,Z-s c o r e大于2的基序具有m i R N A基因启动子特异性,与m i R N A的转录调控有关的可能性较高[22];而Z-s c o r e小于2的基序在其他基因组区域普遍存在,因此不作为m i R N A启动子重要基序进行研究㊂根据以上标准,获得了3个Z-s c o r eȡ2的小麦m i R N A启动子特异性基序(表1)㊂表1小麦m i R N A基因启动子特异性基序T a b l e1S p e c i f i cm o t i f s o fw h e a tm i R N A g e n e p r o m o t e r s基序M o t i f序列C o n s e n s u s s e q u e n c e E值E-v a l u eZ值Z-s c o r e基序1M o t i f1T T A G T C C C G G1.40e-644.4基序2M o t i f2T T G A A A A A A A6.60e-263.4基序10M o t i f10C A T A T A T A T A2.10e+052.0除顺式作用元件外,C p G岛也是真核生物p o lⅡ型启动子的重要特征之一㊂由于本研究中M I R9670和M I E979可能通过同一个启动子进行转录,因此对114个m i R N A基因启动子的C p G 岛进行分析,C p G P l o t预测结果表明,61.4%的小麦m i R N A基因T S S上游序列有C p G岛分布,启动子区域含有1㊁2㊁3和4个C p G岛的m i R N A 基因分别有41㊁17㊁10㊁2个㊂3讨论本研究首先将m i R B a s e数据库目前登录的所有小麦p r e-m i R N A序列定位于小麦基因组上,在122个p r e-m i R N A中有部分序列无法通过b l a s t获得基因座,其可能原因为:(1)基因位于数据库中的未知染色体上;(2)p r e-m i R N A的序列信息不完全,或所研究品种的p r e-m i R N A序列与参考的中国春基因组序列存在差异;(3)由于小麦基因组较大,组装困难,目前提供的基因组版本存在部分染色体序列的缺失㊂本研究染色体定位结果表明,所有小麦染色体上均存在m i R N A基因㊂前人研究表明,在三个染色体组中,B组染色体上的m i R N A基因分布最多,根据I WG S C数据库,编码蛋白的基因也在B组染色体上的分布最多[21]㊂本研究选择b l a s t结果为100%的染色体位置为m i R N A基因座,因此多拷贝的m i R N A 基因序列相同㊂具有多拷贝的m i R N A基因中,只有M I R6197和M I R9774在三个染色体组上均具有拷贝,其他基因只在一个或两个染色体组上㊃6541㊃麦类作物学报第41卷具有拷贝,这说明大部分基因在不同染色体组上存在序列不同的情况㊂在动物中,m i R N A基因通常聚簇并形成多顺反子R N A共转录,而只有部分植物m i R N A基因存在成簇m i R N A㊂与非成簇m i R N A不同,成簇的多个m i R N A可通过同一个启动子进行转录[18]㊂S i n g h等[34]研究表明,小麦中209个m i R N A存在于89个多顺反子基因座上㊂本研究中,由于使用的m i R B a s e数据库的注释m i R N A信息有限,只发现了1个小麦m i R N A簇,该m i R N A簇中的M I R9670和M I R9779位于6D染色体上,为非保守m i R N A,未在S i n g h等[35]的研究中报道㊂对M I R9670和M I R9779的启动子预测结果发现,只有一个m i R-N A启动子位于上游序列,说明这两个m i R N A 可能通过同一个启动子进行转录㊂小麦成簇m i R N A的启动子特点可通过其他m i R N A库进行更深层次的研究㊂150个m i R N A基因中有148个具有启动子潜在区域,M I R1133和M I R1135基因与上游蛋白质编码基因距离过近,无法获得启动子区域㊂本研究通过T S S P对小麦m i R N A基因的p o lⅡ型启动子进行了预测,结果表明,大部分p r e-m i R-N A(77.7%)上游具有潜在的启动子序列,而少部分m i R N A基因无法预测到启动子,原因可能为:(1)原始m i R N A序列较长,利用p r i-R N A加工后形成p r e-m i R N A序列信息进行启动子预测,其启动子可能位于p r e-m i R N A的上游2k b以外;(2)大多数启动子预测软件都使用同源搜索的方法,因此可能无法预测m i R N A启动子的非保守性启动子;(3)由于基因组的重复性,部分基因组上具有多个拷贝的p r e-m i R N A序列为假基因,不发生转录,因此无法进行启动子预测[19]㊂m i R-N A根据基因位置分为基因间m i R N A和基因内m i R N A,基因内m i R N A通常与宿主基因共同转录,但C u i等[18]的研究表明,基因内m i R N A也可能具有单独的启动子,形成独立的转录本㊂本研究对基因内m i R N A和基因间m i R N A启动子数目分别进行了统计,发现74.3%的基因内m i R-N A至少具有1个p o lⅡ型启动子㊂以上结果表明,小麦中相当一部分的基因内m i R N A也同样具有独立的启动子,而未预测到启动子的基因内m i R N A则可能由宿主基因启动子启动转录㊂T S S是基因的转录起始位点,因此T S S的预测对于m i R N A基因转录特点的研究具有一定的意义㊂本研究对T S S与p r e-m i R N A的距离进行统计分析,结果表明,T S S大多数位于p r e-m i R-N A序列上游800b p内,尤其上游200b p内㊂该结果与大豆和水稻中的m i R N A基因T S S统计结果类似[18-19],这说明小麦等植物的大多数m i R-N A核心启动子区域与p r e-m i R N A序列比较接近,m i R N A的P o lⅡ启动子近端区域的核心启动子区可能对m i R N A的转录起到更大的作用㊂植物基因启动子上的顺式作用元件能够识别结合特定的转录因子,从而对基因的转录进行相应的时空特异性调控[24]㊂本研究对T S S上游序列进行了顺式作用元件分析,结果表明,m i R N A 基因启动子区域存在多种顺式作用元件㊂其中T A T A-b o x最多,T A T A-b o x是一种广泛存在的D N A基序,拟南芥和水稻中m i R N A特异性基序的功能尚不清楚,但新发现的基序对于在小麦中鉴定新的特异性m i R N A以及进行m i R N A的试验分析具有一定的借鉴意义㊂除顺式作用元件外,C p G岛也是重要的启动子序列特征[35]㊂本研究在小麦中部分m i R N A基因上游序列鉴定出了C p G岛,而前人在拟南芥m i R N A启动子中未鉴定到C p G岛,水稻m i R N A启动子中鉴定出的C p G岛也较少[15],烟草中的M I R169基因家族中也未鉴定到C p G岛的存在[36]㊂以上结果说明,小麦㊁水稻等单子叶植物中,C p G岛的分布情况可能与双子叶植物不同㊂m i R N A在植物的基因调控中起到了重要作用,启动子是控制m i R N A基因表达的重要结构,因此对于m i R N A基因启动子的分析研究具有较大的意义㊂本研究利用公布的小麦基因组信息对小麦m i R N A启动子进行了分析,研究了小麦m i R N A的染色体定位以及T S S分布㊁顺式作用元件特异性等启动子特征,相关结果对于小麦m i R N A表达调控的研究及新m i R N A的预测具有一定的借鉴意义㊂在未来的研究中,随着小R N A测序以及分子实验技术的进步,可获得更多的m i R N A功能信息,并结合试验方法对相关结果进行进一步的验证㊂参考文献:[1]L IC,Z H A N GB.M i c r o R N A s i n c o n t r o l o f p l a n t d e v e l o p m e n t [J].J o u r n a l o f C e l l u l a rP h y s i o l o g y,2016,231(2):303.[2]B A S S O M F,F E R R E I R A PC G,K O B A Y A S H IA K,e ta l. M i c r o R N A s a n dn e wb i o t e c h n o l o g i c a l t o o l s f o r i t sm o d u l a t i o n a n d i m p r o v i n g s t r e s s t o l e r a n c e i n p l a n t s[J].P l a n tB i o t e c h-n o l o g y J o u r n a l,2019,17(8):1482.[3]S A B Z E H Z A R IM,N A G H A V IM R.P h y t o-m i R N A:A m o l e-㊃7541㊃第12期任治鹏等:小麦m i R N A启动子的基因组分析c u l e w i t h b e n e f i c i a la b i l i t i e sf o r p l a n t b i o t e c h n o l o g y[J].G e n e,2019,683:28.[4]A N U S H R E E N,S H I V A P R A S A D P V.R e g u l a t i o no f p l a n t m i R N Ab i o g e n e s i s[J].P r o c e e d i n g so f t h eI n d i a n N a t i o n a l S c i e n c eA c a d e m y,2017,95:439.[5]A C H K A R N P,C AM B I A G N O D A,MA N A V E L L A P A. M i R N Ab i o g e n e s i s:A d y n a m i c p a t h w a y[J].T r e n d s i nP l a n t S c i e n c e,2016,21(12):1034.[6]S I N G H A,G A U T AM V,S I N G HS,e t a l.P l a n t s m a l l R N A s:A d v a n c e m e n t i nt h eu n d e r s t a n d i n g o fb i o g e n e s i sa n dr o l e i n p l a n t d e v e l o p m e n t[J].P l a n t a,2018,248(3):545. [7]T Y A G IS,S H A R MA S,G A N I E S A,e ta l.P l a n t m i c r o R-N A s:B i o g e n e s i s,g e n es i l e n c i n g,w e b-b a s e da n a l y s i s t o o l sa n d t h e i r u s e a sm o l e c u l a rm a r k e r s[J].3B i o t e c h,2019,9(11): 413.[8]WA N GJ,M E I J,R E N G.P l a n tm i c r o R N A s:B i o g e n e s i s,h o-m e o s t a s i s,a n dd e g r a d a t i o n[J].F r o n t i e r si n P l a n tS c i e n c e, 2019,10:360.[9]Y A N G G D,Y A N K,WU BJ,e t a l.G e n o m e w i d e a n a l y s i so fi n t r o n i cm i c r o R N A s i n r i c e a n d A r a b i d o p s i s[J].J o u r n a l o fG e n e t i c s,2012,91(3):313.[10]C H E N K,R A J E W S K Y N.T h ee v o l u t i o no f g e n er e g u l a t i o nb y t r a n sc r i p t i o nf a c t o r sa nd m i c r o R N A s[J].N a t u re R e-v i e w sG e n e t i c s,2007,8(2):93.[11]陈敏,陈慧,包海,等.植物m i R N A启动子研究进展[J].中国生物工程杂志,2016,36(5):125.C H E N M,C H E N H,B A O H,e ta l.R e s e a r c h p r o g r e s so f p l a n tm i R N A p r o m o t e r s[J].C h i n e s eJ o u r n a l o f B i o e n g i-n e e r i n g,2016,36(5):125.[12]L E E Y,K I M M,HA NJ,e ta l.M i c r o R N A g e n e sa r et r a n-s c r i b e db y R N A p o l y m e r a s e I I[J].E M B OJ o u r n a l,2004,23 (20):4051.[13]M E G R AW M,B A E V V,R U S L N O V V,e ta l.M i c r o R N A p r o m o t e r e l e m e n t d i s c o v e r y i n A r a b i d o p s i s[J].R N A,2006, 12(9):1612.[14]X I EZ,A L L E NE,F A H L G R E N N,e t a l.E x p r e s s i o n o f A r a-b i d o p s i s m i R N A g e n e s[J].P l a n t P h y s i o l o g y,2005,138(4):2145.[15]Z HO U X,R U A NJ,WA N G G,e t a l.C h a r a c t e r i z a t i o na n d i-d e n t i f i c a t i o no fm i c r o R N A p r o m o t e r s i nf o u rm o d e l s p e c i e s [J].P l o sC o m p u t a t i o n a lB i o l o g y,2005,3(3):e37.[16]Z HA O X,L IL.C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o fm i c r o R N A p r o m o t-e r s i n A r a b i d o p s i s a n d r i c e[J].G e n o m i c sP r o t e o m i c sB i o i n-f o r m a t i c s,2013,11(1):56.[17]Z HA O X,Z H A N G H,L I L.I d e n t i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s o f t h e p r o x i m a l p r o m o t e r s o fm i c r o R N A g e n e s i n A r a b i d o p s i s[J].G e n o m i c s,2013,101(3):187.[18]C U IX,X US M,MU DS,e t a l.G e n o m i c a n a l y s i s o f r i c em i-c r o R N A p r o m o t e r s a nd c l u s te r s[J].G e n e,2009,431(1/2):61.[19]L I U YX,H A N YP,C H A N G W,e t a l.G e n o m i cA n a l y s i s o f m i c r o R N A p r o m o t e r sa n dt h e i rc i s-a c t i n g e l e m e n t s i ns o y-b e a n[J].A g r i c u l t u r a lS c i e n c e si n C h i n a,2010,9(11): 1561.[20]H A N Y Q,HUZ,Z H E N GDF,e t a l.A n a l y s i s o f p r o m o t e r s o fm i c r o R N A s f r o ma G l y c i n em a x d e g r a d o m e l i b r a r y[J]. J o u r n a l o f Z h e j i a n g U n i v e r s i t y(B i o m e d i c i n e a n dB i o t e c h-n o l o g y),2014,15(2):125.[21]K A N J A N AWA T T A N AWO N G S,T A N G P H A T S O R N R U-A N G S,T R I W I T A Y A K O R N K.e ta l.C h a r a c t e r i z a t i o no fr u b b e r t r e em i c r o R N A i n p h y t o h o r m o n e r e s p o n s e u s i n g l a r g e g e n o m i cD N Al i b r a r i e s,p r o m o t e r s e q u e n c e a n d g e n e e x p r e s-s i o na n a l y s i s[J].M o l e c u l a rG e n e t i c sa n d G e n o m i c s,2014, 289(5):921.[22]Z HO U M,S U NJ,WA N G Q H,e t a l.G e n o m e-w i d e a n a l y s i s o f c l u s t e r i n gp a t t e r n sa n df l a n k i n g c h a r a c t e r i s t i c sf o r p l a n t m i c r o R N A g e n e s[J].F E B SJ o u r n a l,2011,278(6):929.[23]K O N G W,Y A N GZ M.I d e n t i f i c a t i o no f i r o n-d e f i c i e n c y r e-s p o n s i v em i c r o R N A g e n e sa n dc i s-e l e m e n t s i n A r a b i d o p s i s [J].P l a n tP h y s i o l o g y a n d B i o c h e m i s t r y,2010,48(2/3): 153.[24]D E V I SJ,MA D H A V M S,K UMA R G R,e ta l.I d e n t i f i c a-t i o no f a b i o t i c s t r e s sm i R N At r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g m o-t i f s(T F B M s)i n r i c e[J].G e n e,2013,531(1):15. [25]S U N F,G U O G,D U J,e ta l.W h o l e-g e n o m ed i s c o v e r y o f m i R N A s a n d t h e i r t a r g e t s i nw h e a t(T r i t i c u ma e s t i v u m L.) [J].B M CP l a n tB i o l o g y,2014,14(1):142. [26]L I U Z,WA N G X,C H E N X,e ta l.T a M I R1139:A w h e a t m i R N Ar e s p o n s i v e t o P i-s t a r v a t i o n,a c t s a c r i t i c a lm e d i a t o r i n m o d u l a t i n gp l a n t t o l e r a n c e t oP i d e p r i v a t i o n[J].P l a n tC e l l R e p o r t s,2018,37(9):1293.[27]G R I F F I T H S-J O N E SS,G R O C O C KRJ,V A N-D O N G E NS,e t a l.M i R B a s e:M i c r o R N As e q u e n c e s,t a r g e t sa n d g e n en o-m e n c l a t u r e[J].N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h,2006,34:140.[28]A L A N U X M,R O G E R S J,L E T E L L I E RT,e t a l.L i n k i n g t h ei n t e r n a t i o n a l w h e a t g e n o m e s e q u e n c i n g c o n s o r t i u m b r e a d w h e a t r e f e r e n c e g e n o m e s e q u e n c e t ow h e a t g e n e t i c a n d p h e-n o m i c d a t a[J].G e n o m eB i o l o g y,2018,19(1):111.[29]V O O R R I P SRE.M a p C h a r t:S o f t w a r e f o r t h e g r a p h i c a l p r e s-e n t a t i o nof l i n k ag em a p s a n dQ T L s[J].Th e J o u r n a l o f H e-r e di t y,2002,93(1):77.[30]B U E L SR,Y A O E,D I E S H C M,e t a l.J B r o w s e:Ad y n a m i c w e b p l a t f o r mf o r g e n o m ev i s u a l i z a t i o na n da n a l y s i s[J].G e-n o m eB i o l o g y,2016,17(1):66.[31]A P P E L S R,E V E R S O L E K,F E U I L L E T C,e ta l.S h i f t i n g t h e l i m i t s i nw h e a t r e s e a r c h a n db r e e d i n g u s i n g a f u l l y a n n o-t a t e dr e f e r e n c e g e n o m e[J].S c i e n c e,2018,361(6403):E A A R7191.[32]L E S C O T M,D E H A I SP,T H I J SG,e t a l.P l a n t C A R E,ad a-t a b a s e o f p l a n t c i s-a c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t s a n d a p o r t a l t o t o o l s f o r i n s i l i c o a n a l y s i s o f p r o m o t e r s e q u e n c e s[J].N u c l e-i cA c i d sR e s e a r c h,2002,30(1):325.[33]B A I L E Y TL,E L K A NC.F i t t i n g am i x t u r em o d e l b y e x p e c-t a t i o nm a x i m i z a t i o n t od i s c o v e rm o t i f s i nb i o p o l y m e r s[J].I n t e r n a t i o n a lC o n f e r e n c e o nI n t e l l i g e n t S y s t e m s f o rM o l e c u-l a rB i o l o g y,1994,2:28.[34]S I N G H A K,S I N G H N,K UMA RS,e t a l.I d e n t i f i c a t i o na n de v o l u t i o n a r y a n a l y s i s of p o l y c i s t r o n i cm i R N Ac l u s t e r s i nd o-m e s t i c a t e da n d w i l d w h e a t[J].G e n o m i c s,2020,112(3): 2334.[35]Z HA O Y,WA N GF,C H E NS,e t a l.M e t h o d s o fm i c r o R N A p r o m o t e r p r e d i c t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o rm e d i a t e d r e g u l a-t o r y n e t w o r k[J].B i o M e d R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l,2017, 2017:7049406.[36]蔡健宇,贾蒙骜,张孝廉,等.烟草m i R N A169基因家族及启动子的生物信息学分析[J].烟草科技,2019,52(10):1.C A I JY,J I A M A,Z H A N GXL,e t a l.B i o i n f o r m a t i c s a n a l y-s i s o f t o b a c c o m i R N A169g e n e f a m i l y a n d p r o m o t e r[J].T o-b a c c oS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,2019,52(10):1.㊃8541㊃麦类作物学报第41卷。

启动子克隆长度原则1.引言1.1 概述启动子克隆是指在遗传工程研究中对于某一基因启动子的特定区域进行克隆和分析的方法。

启动子是基因表达的调控序列，在基因的转录起始点附近，通常有一段长度不等的序列被称为启动子序列。

研究启动子克隆的目的是为了深入了解基因的表达调控机制以及生物体的发育、生长和生理过程。

在过去的研究中，启动子克隆的长度并没有受到十分严格的限制，往往根据研究者的需要而定。

然而，随着技术的不断进步和研究的深入，越来越多的证据表明启动子的长度对于基因表达的调控起着重要的作用。

因此，启动子克隆长度原则的提出成为了当前研究的热点之一。

启动子克隆长度原则的核心观点是：启动子克隆的长度应该足够包含关键的调控元件以确保准确的基因表达调控。

具体来说，启动子克隆的长度应该包括以下的要点：1. 转录起始点（TSS）附近的核心区域，这是基因表达起始的关键区域，往往包含着调控因子结合位点和转录因子结合位点。

2. 转录因子结合位点的多态性，即基因启动子区域的多样性，通过多态位点的存在，可以增加基因表达调控的灵活性和适应性。

3. 启动子的保守性，在不同物种中具有高度保守性的启动子区域往往意味着其在基因表达调控中的重要作用。

总之，启动子克隆长度原则的提出为准确解析基因表达调控机制提供了重要的指导。

通过遵循启动子克隆长度原则，研究者能够更全面地了解基因的功能以及其在生物体发育和生理过程中的作用，为进一步的研究提供了坚实的基础。

随着技术的不断发展，我们有理由相信启动子克隆长度原则将在基因研究领域发挥越来越重要的作用。

1.2 文章结构本文将分为引言、正文和结论三个部分，来探讨启动子克隆长度原则的相关内容。

在引言部分，我们将通过概述来介绍本文的主题，即启动子克隆长度原则。

我们将阐述启动子克隆的定义和重要性，并说明本文的目的，以使读者对本文的主要内容有一个整体的了解。

在正文部分，我们将详细介绍启动子克隆长度原则的意义。

首先，我们将解释启动子克隆长度原则对于启动子克隆研究的重要性。

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2019.20.022miR⁃148a 及其相关通路在疾病表达的研究进展①曾菁莘　温　炬　罗　权②　(广东省第二人民医院皮肤科,广州510317) 中图分类号　R392.12 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2019)20⁃2550⁃05①本文受广东省医学科研基金(A2016542)和广东省企业技术研发与省级改造专项资金项目(2013B021800044)资助㊂②广州市皮肤病防治所,广州510095㊂作者简介:曾菁莘,女,硕士,主要从事皮肤免疫学方面研究,E⁃mail:zengjingxin6@㊂通讯作者及指导教师:罗　权,男,博士,主要从事皮肤免疫学机制方面研究,E⁃mail:luoquan666@㊂[摘　要]　微小RNA(miRNA)是一种高度保守的内源性非编码小分子单链RNA,其可以通过与靶基因mRNA 的3′端非翻译区(3′UTR)结合而发挥作用,因而其参与调节许多重要细胞功能,例如细胞增殖㊁分化㊁凋亡和新陈代谢等,从而诱导人类疾病的发生㊂miR⁃148a 异常表达于多种疾病中,本文主要拟述miR⁃148a 在免疫系统,肿瘤细胞及表观遗传学的调控机制,以期呈现miR⁃148a 及其相关通路在自身免疫性疾病,慢性炎症性疾病及肿瘤中作为新兴生物学标记物及潜在治疗靶点的重要角色㊂[关键词]　miR⁃148a;调控机制;淋巴细胞;免疫;肿瘤Research progress of miR⁃148a and its related pathways in disease and regula⁃tionZENG Jing⁃Xin ,WEN Ju ,LUO Quan .Department of Dermatdogy ,Guangdong Second Provincial General Hospital ,Guangzhou 510317,China[Abstract ]　MicroRNAs(miRNAs)are highly conserved noncoding RNAs.Through specifically pairing with complementary sitesin 3′untranslated regions(UTRs)of target mRNAs,they have been implicated in many physiological process includingproliferationn,dif⁃ferentiation,development,apoptosis,andmetabolism,thus induce all kinds of diseases.Mir⁃148a is aberrantly expressed in various diseases,we will focus on the regulation of miR⁃148a inimmune system,cancer cell and epigenetics,presenting the functional role of miR⁃148a and its related pathways is promising biological marker and potential therapeutic targets for treatment of autoimmunedisorders,chronic inflammatory diseases and multiple types of cancer.[Key words ]　miR⁃148a;Regulation;Lymphocytes;Immune;Cancer MicroRNAs 是一种在基因表达谱进化中高度保守,具有调控功能的内源性非编码小RNA,其可与靶基因mRNA 的3′UTR 通过碱基互补配对的方式结合而降解靶基因mRNA 或阻止其翻译[1]㊂miRNAs 与靶基因mRNA 结合程度的不同导致靶基因表达的比例不一㊂单个miRNA 可调节多种靶基因的mRNA,多种miRNA 也可调节同种靶基因的mRNA,因此由microRNA 及其靶基因所形成的复杂而精密的调控网可参与调节体内多种重要的生理过程,如器官发育㊁细胞增殖㊁分化和凋亡等[2,3],其在免疫调控及疾病的发生发展中也起着重要作用㊂其中miR⁃148a 在炎症性疾病及肿瘤的免疫学机制中均存在反馈调节作用,近年来已成为相关疾病的研究热点之一㊂1　miR⁃148a 的结构及表达调控1.1　microRNA⁃148a 的结构　miR⁃148/miR⁃152家族是由miR⁃148a㊁miR⁃148b 和miR⁃152共同组成,三者具有相似的结构及相同的种子序列(UCAGUGCA),拥有茎环结构miR⁃148/miR⁃152前体可被核内及胞质内的酶裂解为miR⁃148a㊁miR⁃148b 和miR⁃152㊂研究表明miR⁃148/miR⁃152接近于人类同源异型基因(Homeobox,HOX),且miR⁃148a㊁miR⁃148b 和miR⁃152分别类似HOXA,HOXC 和HOXB [4]㊂在人类染色体中,成熟的miR⁃148a 由22个核苷酸序列组成,含有一个8个核苷酸区域的种子序列”,该序列是结合靶基因mRNA 的重要区域㊂在正常的生理状态下,miR⁃148a 可表达在各种人类组织中,如心脏㊁肝脏㊁脑部㊁胸腺㊁胰腺㊁肾脏㊁皮肤㊁胎盘㊁子宫㊁睾丸和造血系统[5]㊂Fu 等[6]发现肝脏内高表达miR⁃148a,且其表达在成人和胚胎中无显著差异㊂Ribeirodossantos等[7]发现miR⁃148a 可表达于正常的胃组织中,尤其在贲门内㊂此外,高表达的miR⁃148a参与胃内主要基因的稳定表达,一旦其出现异常表达则会导致胃癌的发生㊂有趣的是,Nielsen等[8]发现在持续12周的运动中,miR⁃148a在外周血中的表达呈显著下降㊂1.2　影响miR⁃148a表达的因素　转录因子(TFs)及甲基化等表观遗传学机制都可作用于microRNAs 启动子调控microRNAs的表达[9]㊂研究表明在胃癌中,DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的过表达使得miR⁃148a基因启动子区域CpG岛超甲基化而致miR⁃148a的沉默,从而减弱其对DNMT1表达的抑制,致使DNMT1蛋白表达水平的进一步上升和miR⁃148a的进一步沉默,由此说明miR⁃148a的沉默和DNMT1蛋白的过度表达可能存在相互促进的正反馈调节作用[10]㊂此外乳腺癌中的研究发现,转录因子EGR1可与miR⁃148a的启动子结合促进其表达[11],神经胶质瘤中转录因子NF⁃κB与miR⁃148a启动子结合将促进miR⁃148a的表达[12]㊂此外,微环境中如缺氧和细胞因子等改变也会影响miR⁃148a的表达㊂Hsiao等[13]研究发现在子宫内膜异位症中低氧可通过AUF1/miR⁃148a通路致使DNA甲基化转移酶1(DNMT1)失调而引起整体低甲基化㊂miR⁃148a可通过抑制其靶基因SMAD2的表达下调细胞因子TGF⁃β的表达介导肿瘤的上皮间充质转化(EMT),起到抗凋亡和减弱细胞的迁移的作用[14]㊂除上述所描述的机制之外,miRNAs还可与长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)相互作用调控靶基因mRNA的表达㊂Yan等[15]通过研究表明胃癌中的lncRNA MEG3呈低表达水平,miR⁃148a可通过调控其下游靶蛋白DNMT1间接调节MEG3的表达进而影响胃癌细胞的生物学过程, MEG3通过调VEGF㊁Notch㊁Rb等通路调控细胞的增殖,凋亡转移等生物学活动㊂Zhao等[16]研究表明LncRNA CCAT1可经由miR⁃148a/PIK3IP1通路上调其表达而促进骨肉瘤的扩散与转移[14]㊂Wu 等[17]也表明LncRNA H19可经由miR⁃148a/DNMT1通路调节喉部鳞状细胞癌的发生发展㊂2　miR⁃148a的生物学特性与相应疾病的调控2.1　miR⁃148a的免疫调节机制　Haftmann等[18]在类风湿性关节炎患者滑膜液分离出的记忆T细胞中检测到显著上调的miR⁃148a,Pan等[19]在系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞的表达也高于正常志愿者㊂反复抗原刺激可使Th1中的转录因子Twist1上调并诱导miR⁃148a的表达,后者可通过抑制促凋亡蛋白Bim表达而促进慢性炎症中反复活化Th1细胞的存活㊂反之,抑制miR⁃148a的表达则可降低慢性炎症中反复活化Th1的存活率㊂Twist1/miR⁃148a/Bim通路可能适用于Th1致病的多种慢性炎症性疾病(风湿性疾病㊁克罗恩病㊁溃疡性结肠炎)[20,21]㊂该团队最新研究显示,microRNA⁃148a特异性抑制剂可在体内选择性靶向促炎性Th1细胞,这进一步推动了miR⁃148a对疾病治疗的进展[22]㊂除了调节T细胞之外,miR⁃148a还可作用于B 细胞㊂Porstner等[23]在研究中表明活化的B细胞可上调miR⁃148a的表达,miR⁃148a上调后又可促进活化的B细胞分化成浆细胞,并且通过抑制转录因子Bach2㊁MITF及促凋亡因子BIM,PTEN来增强浆细胞的存活率㊂Gonzalezmartin等[24]研究发现上调miR⁃148a通过其上述抑制凋亡的作用促进幼稚B 细胞的表达从而增加B细胞受体数量而达到瓦解B 细胞免疫耐受的效果,而这也是自身免疫性疾病的发病机制之一㊂2.2　miR⁃148a的免疫相关靶标　人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)广泛表达于细胞表面,其可通过呈递抗原给T细胞而介导免疫反应发生㊂HLA⁃C隶属经典HLA⁃Ⅰ类分子,位于HLA⁃C 终止密码子下游263位点的缺失(263del)和插入(263ins)会直接影响miR⁃148a与其末端3′UTR的结合,263ins(G)支持miR⁃148a与HLA⁃C末端的结合从而抑制HLA⁃C的表达,而使HIV病毒表达上升同时也可降低克罗恩病的风险㊂263del的HLA⁃C末端则不能与miR⁃148a结合而起作用[25]㊂HLA⁃G是一种非经典HLA⁃Ⅰ类分子,研究表明其可通过抑制杀伤毒性T细胞和NK细胞介导肿瘤细胞的免疫逃逸[26],其可表达于滋养细胞肿瘤㊁黑色素瘤㊁胃癌㊁肺癌㊁肾细胞癌以及结直肠癌等多种肿瘤[27]㊂多项研究表明miR⁃148a的下调将导致HLA⁃G表达的升高[28]㊂有趣的是,Sun等[29]发现宫颈癌中lncRNA HOTAIR可与miR⁃148a竞争性结合而减少其与HLA⁃G的3′UTR结合,从而促进HLA⁃G的表达,HOTAIR可促进宫颈癌细胞的增殖和迁移㊂此外,miR⁃148a可靶向作用于蛋白激酶CaMKIIα而削弱树突细胞的抗原提呈及固有免疫[30]㊂蛋白激酶CaMKIIα还可降低MHCⅡ类分子的表达和抗原特异性T细胞的增殖[31]㊂2.3　miR⁃148a对细胞增殖的调控机制　CAND1是E3泛素连接酶的支架蛋白,泛素连接酶及CAND1复合物在细胞的增殖和分化中起着重要的作用, miR⁃148a可通过抑制CAND1的表达控制前列腺癌细胞的增殖[32]㊂研究表明抑癌基因MIG6可调节表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的表达进而诱导细胞增殖,miR⁃148a通过下调MIG6的表达从而抑制神经胶质瘤细胞增殖[33]㊂ROCK1蛋白可调节多种关键细胞功能,在细胞的增殖㊁迁移和活化中发挥生理功能,近年来研究表明ROCK1在肿瘤发生发展中也有着关键作用,miR⁃148a过表达可抑制ROCK1从而下调胃癌细胞的增殖水平[34]㊂胰岛素受体底物⁃1(Insulin receptor substrate1,IRS⁃1)和类胰岛素生长因子Ⅰ受体(Insulin⁃like growth factors⁃I receptor,IGF⁃ⅠR)可诱导多个信号级联通路,包括PI3K/AKT和MAPK/ ERK,两条通路皆能控制肿瘤的发生发展,Xu等[35]研究表明miR⁃148a可靶向作用于IRS⁃1和IGF⁃ⅠR 进而抑制乳腺癌细胞的增殖及血管生成㊂2.4　miR⁃148A对细胞迁移与侵袭的调节　上皮间充质转化(Epithelialmesenchymal transition,EMT)在形态学上发生间充质细胞表型的转变,并获得转移能力的过程,长久以来一直被认为在胚胎发育和恶性肿瘤的细胞转分化中起主导作用,其涉及TGF⁃β㊁WNT信号通路,E⁃钙黏素表达等多种信号通路的表达[36]㊂SMAD2是TGF⁃β通路的下游效应蛋白,其可促进TGF⁃β诱导EMT,即促进细胞的迁移和侵袭[37]㊂高活性的TGF⁃β/Smad通路增强胃癌细胞的侵袭和转移且预后较差,尤其是在已扩散的胃癌患者中[38]㊂Wang等[14]的研究表明Smad2是miR⁃148a的靶基因,miR⁃148a可抑制Smad2的表达从而抑制TGF⁃β介导的EMT,起到抗凋亡和减弱细胞迁移的作用㊂此外,多项研究表明子宫内膜癌和肝癌中miR⁃148a可分别靶向作用于WNT1和WNT10B,进而抑制EMT所致的肿瘤转移与侵袭[39,40]㊂在肝癌中miR⁃148a的下降可靶向调控HPIP以及下游的分子AKT/ERK/FOXO4/ATFS通路,促进肿瘤细胞的增殖,转移和侵袭[41]㊂2.5　miR⁃148a对细胞凋亡的调节　Bcl⁃2相关蛋白按照结构和功能可分为三个家族:Bcl⁃2家族㊁Bax 家族和BH3⁃only家族㊂Bcl⁃2家族蛋白具有拮抗细胞凋亡的作用,Bax和BH3⁃only家族蛋白具有促进细胞凋亡的作用㊂Bax㊁Bak等促凋亡蛋白可以结合在线粒体膜上并发生聚合,从而最终导致凋亡的发生㊂BH3⁃only家族成员,例如Bim(Bcl⁃2interacting media⁃tor of cell death),又能够与Bcl⁃2相结合,抑制其抗凋亡作用[42]㊂Kim等[33]研究表明上调miR⁃148a可抑制BIM的表达从而抑制神经胶质瘤细胞凋亡㊂3　展望随着近年来对miR⁃148a研究的不断深入,可以发现miR⁃148a在T细胞及B细胞介导的慢性炎症性疾病㊁自身免疫性疾病及肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用,miR⁃148a的表达也与DNMT1㊁转录因子㊁lncRNA及细胞因子等息息相关㊂然而, miR⁃148a在疾病中的调控机制复杂,靶基因众多,这些靶基因之间是否存在相互作用,miR⁃148a的表达通路是否相互影响都有待实验进一步证实㊂相信在不久的将来,miR⁃148a将成为疾病的诊断和预后中的生物标记物和新兴的治疗靶点㊂表1　miR⁃148a在各组织/细胞中的靶标Tab.1　Targets of miR⁃148/152family in various tissues/cellsmiR⁃148a Biological function Targets Tissues/Cells References ↑DNA hypomethylation DNMT1CD4+T cells of Systemiclupuserythematosus[16]↑Apoptosis BIM CD4+T cells of chronic inflammatory disease[17]↑Apoptosis PTEN BIM Gadd45a B cell of autoimmune disease[19]↓Immune rejection HLA⁃G Placenta tissue cervical cancer cell[22][23]↓Cell proliferation HLA⁃C HIV⁃1infected individuals[21]↑Cell proliferation CAND1Prostate cancer cells[29]↑Cell proliferation MIG6Glioma cells[30]↓Cell invasion and metastasis ROCK1Gastric cancer[31]↑Epithelial mesenchymal transition SMAD2Gastric cancer[35]参考文献:[1]　Paladini L,Fabris L,Bottai G,et al.Targeting microRNAs as keymodulators of tumor immune response[J].J Exp Clin Cancer Res Cr,2016,35(1):1⁃19.[2]　Bartel DP.MicroRNA target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215⁃233.[3]　郭　莹,瞿　文,王一浩,等.microRNA在自身免疫性疾病中的研究进展[J].中国免疫学杂志,2016,32(8):1237⁃1240.Guo Y,Qu W,Wang YH,et al.Research progress of microRNA in autoimmune diseases[J].Chin J Immunol,2016,32(8): 1237⁃1240.[4]　Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,et al.Human microRNAgenes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(9): 2999⁃3004.[5]　Barad O,Meiri E,Avniel A,et al.MicroRNA expression detectedby oligonucleotide microarrays:system establishment and expression profiling inhuman tissues[J].Genome Res,2004,14: 2486⁃2494.[6]　Fu HJ,TieY,Xu CW,et al.Identification of human fetal livermiRNAs by a novel method[J].FEBS Lett,2005,579(17): 3849⁃3854.[7]　Ribeiro⁃dos⁃santos A,Khayat AS,Silva A,et al.Ultra⁃deepsequencing reveals the microRNA expression pattern of the human stomach[J].PLoS One,2010,5(10):e13205.[8]　Nielsen S,Akerstrom T,Rinnov A,et al.The miRNA plasmasignature inresponse to acute aerobic exercise and endurance training[J].PLoS One,2014,9:e87308.[9]　Schanen BC,Li X.Transcriptional regulation of mammalian miRNAgenes[J].Genomics,2011,97:1⁃6.[10]　Zuo JB,Xia JZ,Ju F,et al.MicroRNA⁃148a can regulate runt⁃related transcription factor3gene expression via modulation ofDNA methyltransferase1in gastric cancer[J].Mol Cells,2013,35(4):313⁃319.[11]　Xu Q,Liu LZ,Yin Y,et al.Regulatory circuit of PKM2/NF⁃κB/miR⁃148a/152⁃modulated tumor angiogenesis and cancerprogression[J].Oncogene,2015,34(43):5482⁃5493. [12]　Wang H,Pan JQ,Luo L,et al.NF⁃κB induces miR⁃148a tosustain TGF⁃β/Smad signaling activation in glioblastoma[J].MolCancer,2015,14(1):2.[13]　Hsiao KY,Wu MH,Chang N,et al.Coordination of AUF1andmiR⁃148a to destabilize DNA methyltransferase1mRNA underhypoxia in endometriosis[J].Mol Hum Reprod,2015,21(12):894⁃904.[14]　Wang SH,Li X,Zhou LS,et al.microRNA⁃148a suppresseshuman gastric cancer cell metastasis by reversing epithelial⁃to⁃mesenchymal transition[J].Tumour Biol,2013,34(6):3705⁃3712.[15]　Yan J,Guo X,Xia J,et al.MiR⁃148a regulates MEG3in gastriccancer by targeting DNA methyltransferase1[J].Med Oncol,2014,31(3):879.[16]　Zhao J,Cheng L.Long non⁃coding RNA CCAT1/miR⁃148a axispromotes osteosarcoma proliferation and migration throughregulating PIK3IP1[J].Acta Biochim Biophy Sin,2017,49(6):1.[17]　Wu T,Qu L,He G,et al.Regulation of laryngeal squamous cellcancer progression by the lncRNA H19/miR⁃148a⁃3p/DNMT1axis[J].Oncotarget,2016,7(10):11553⁃11566. [18]　Haftmann C,Stittrich AB,Zimmermann J,et al.miR⁃148a isupregulated by Twist1and T⁃bet and promotes Th1⁃cell survivalby regulating the proapoptotic gene Bim[J].Eur J Immunol,2015,45(4):1192.[19]　Pan W,Zhu S,Yuan M,et al.MicroRNA⁃21and microRNA⁃148acontribute to DNA hypomethylation in lupus CD4+T cells bydirectly and indirectly targeting DNA methyltransferase1[J].JImmunol,2010,184(12):6773.[20]　Dai R,Zhang Y,Khan D,et al.Identification of a common lupusdisease⁃associated microRNA expression pattern in three differentmurine models of lupus[J].PLoS One,2010,5(12):e14302.[21]　赵振安,曹忠胜.microRNA在调节变应性疾病Th1/Th2平衡中作用的研究进展[J].中国免疫学杂志,2015,31(8):1151⁃1152.Zhao ZA,Cao ZS.Advances in the role of microRNA in regulatingTh1/Th2balance in allergic diseases[J].Chin J Immunol,2015(8):1151⁃1152.[22]　Maschmeyer P,Zimmermann J,Tran CL,et al.Systemic inhibitionof MIR⁃148A by antagomirs reduces CD4+T helper cell numbersand alleviates inflammation in a preclinical model of transfercolitis[J].Ann Rheum Dis,2016,75(Suppl1):A62⁃A63. [23]　Porstner M,Winkelmann R,Daum P,et al.miR⁃148a promotesplasma celldifferentiation and targets the ger minal centertranscription factors Mitf and Bach2[J].Eur J Immunol,2015,45:1206⁃1215.[24]　Gonzalezmartin A,Adams BD,Lai M,et al.The microRNA miR⁃148a functions as a critical regulator of B cell tolerance and auto⁃immunity[J].Nat Immunol,2016,17(4):433⁃440. [25]　Kulkarni S,Qi Y,O′Huigin C,et al.Genetic interplay betweenHLA⁃C and MIR148A in HIV control and Crohn disease[J].ProcNatl Acad Sci U S A,2013,110(51):20705⁃20710. [26]　Zeng XC,Zhang T,Huang DH,et al.RNA interfering targetinghuman leukocyte antigen⁃G enhanced immune surveillancemediated by the natural killer cells on hepatocellular carcinoma[J].Ann Clin Lab Sci,2013,43(2):135⁃144. [27]　Seliger B.Role of microRNAs on HLA⁃G expression in humantumors[J].Hum Immunol,2016,77(9):760⁃763. [28]　Manaster I,Goldmanwohl D,Greenfield C,et al.MiRNA⁃mediated control of HLA⁃G expression and function[J].PLoSOne,2012,7(3):e33395.[29]　Sun J,Chu H,Ji J,et al.Long non⁃coding RNA HOTAIRmodulates HLA⁃G expression by absorbing miR⁃148a in humancervical cancer[J].Int J Oncol,2016,49(3):943⁃952. [30]　Liu X,Zhan Z,Xu L,et al.MicroRNA⁃148/152impair innateresponse and antigen presentation of TLR⁃triggered dendriticcells by targeting CaMKIIα[J].J Immunol,2010,185(12):7244⁃7251.(下转第2558页)treatment of tuberculosis[J].Chin J Lung Dis(ElectronicEdition),2016,9(2):204⁃206.[30]　Huang Z,Luo Q,Guo Y,et al.Mycobacterium tuberculosis⁃induced polarization of human macrophage orchestrates theformation and development of tuberculous granulomas in vitro[J].PLoS One,2015,10(6):e129744.[31]　汪毅平,刘　真,张亚洁,等.结核性创面大鼠模型中巨噬细胞极化改变[J].中华损伤与修复杂志(电子版),2018,13(1):30⁃36.Wang YJ,Liu Z,Zhang YJ,et al.Changes of macrophagepolarization in rat models of tuberculosis wound[J].Chin J InjuryRepair and Wound Healing(Electronic Edition),2018,13(1):30⁃36.[32]　Cyktor JC,Carruthers B,Kominsky RA,et al.IL⁃10inhibitsmature fibrotic granuloma formation during Mycobacteriumtuberculosis infection[J].J Immunol(Baltimore,Md.:1950),2013,190(6):2778⁃2790.[33]　Das P,Rampal R,Udinia S,et al.Selective M1macrophagepolarization in granuloma⁃positive and granuloma⁃negativeCrohn′s disease,in comparison to intestinal tuberculosis[J].IntRes,2018,16(3):426⁃435.[34]　申东梅,方毅敏,申雁鸣,等.结核特异性多肽E6㊁E7和C14对单核⁃巨噬细胞亚型极化的影响[J].中国医药生物技术,2016,11(3):216⁃223.Shen DM,Fang YM,Liu GB,et al.The influence of theMycobacterium tuberculosis(MTB)⁃specific peptides E6,E7andC14on the monocyte⁃macrophage polarization[J].Chin MedBiotechnol,2016,11(3):216⁃223.[35]　Durward⁃Diioia M,Harms J,Khan M,et al.CD8+T cellexhaustion,suppressed gamma interferon production,and delayedmemory response induced by chronic Brucella melitensis infection[J].Infect Immun,2015,83(12):4759⁃4771. [36]　Vitry MA,Hanot MD,De Trez C,et al.Humoral immunity andCD4+Th1cells are both necessary for a fully protective immuneresponse upon secondary infection with Brucella melitensis[J].JImmunol,2014,192(8):3740⁃3752.[37]　Ganji A,Mosayebi G,Ghaznavi⁃Rad E,et al.Evaluation ofregulatory T cells in patients with acute and chronic brucellosis[J].Rep Biochem Mol Biol,2017,5(2):91⁃96. [38]　Ahmed W,Zheng K,Liu ZF.Establishment of chronic infection:brucella′s stealth strategy[J].Front Cell Infect Microbiol,2016,6:30.[39]　Arias MA,Santiago L,Costas⁃Ramon S,et al.Toll⁃like receptors2and4cooperate in the control of the emerging pathogen brucellamicroti[J].Front Cell Infect Microbiol,2016,6:205. [40]　Xavier MN,Winter MG,Spees AM,et al.PPARγ⁃mediatedincrease in glucose availability sustains chronic Brucella abortusinfection in alternatively activated macrophages[J].Cell HostMicrobe,2013,14(2):159⁃170.[41]　Chawla A.Control of macrophage activation and function byPPARs[J].Circulation Res,2010,106(10):1559⁃1569. [42]　Barbier T,Nicolas C,Letesson JJ.Brucella adaptation and survivalat the crossroad of metabolism and virulence[J].FEBS Lett,2011,585(19):2929⁃2934.[43]　Zhang M,Gillaspy AF,Gipson JR,et al.Neuroinvasive listeriamonocytogenes infection triggers IFN⁃activation of microglia andupregulates microglial miR⁃155[J].Front Immunol,2018,9:2751.[44]　Biswas A,Banerjee P,Mukherjee G,et al.Porin of Shigelladysenteriae activates mouse peritoneal macrophage through Toll⁃like receptors2and6to induce polarized type I response[J].Mole Immunol,2007,44(5):812⁃820.[45]　Eisele NA,Ruby T,Jacobson A,et al.Salmonella require the fattyacid regulator PPARδfor the establishment of a metabolicenvironment essential for long⁃term persistence[J].Cell HostMicrobe,2013,14(2):171⁃182.[46]　Shirey KA,Cole LE,Keegan AD,et al.Francisella tularensis livevaccine strain induces macrophage alternative activation as asurvival mechanism[J].J Immunol(Baltimore,Md.:1950),2008,181(6):4159⁃4167.[收稿2019⁃02⁃07](编辑　刘格格)(上接第2553页)[31]　Herrmann TL,Agrawal RS,Connolly SF,et al.MHC Class IIlevels and intracellular localization in human dendritic cells areregulated by calmodulin kinase II[J].J Leukoc Biol,2007,82(3):686⁃699.[32]　Murata T,Takayama K,Katayama S,et al.miR⁃148a is anandrogen⁃responsive microRNA that promotes LNCaP prostate cellgrowth by repressing its target CAND1expression[J].ProstateCancer Prostatic Dis,2010,13(4):356⁃361.[33]　Kim J,Zhang Y,Skalski M,et al.microRNA⁃148a is a prognosticoncomiR that targets MIG6and BIM to regulate EGFR andapoptosis in glioblastoma[J].Cancer Res,2014,74(5):1541⁃1553.[34]　Zheng B,Liang L,Wang C,et al.MicroRNA⁃148a suppressestumor cell invasion and metastasis by downregulating ROCK1ingastric cancer[J].Clin Cancer Res,2011,17(24):7574⁃7583.[35]　Xu Q,Liu LZ,Yin Y,et al.Regulatory circuit of PKM2/NF⁃B/miR⁃148a/152⁃modulated tumor angiogenesis and cancerprogression[J].Oncogene,2015,34(43):5482⁃5493. [36]　Charpentier M,Martin S.Interplay of stem cell characteristics,EMT,and microtentacles in circulating breast tumor cells[J].Cancers(Basel),2013,5(4):1545⁃1565.[37]　Valcourt U,Kowanetz M,Niimi H,et al.TGF⁃beta and the Smadsignaling pathwaysupport transcriptomic reprogram ming duringepithelial⁃mesenchymal cell transition[J].Mol Biol Cell,2005,16(4):1987⁃2002.[38]　Shinto O,Yashiro M,Toyokawa T,et al.Phosphorylated smad2inadvanced stage gastric carcinoma[J].BMC Cancer,2010(10):652.[39]　Yan H,Dong X,Zhong X,et al.Inhibitions of epithelial tomesenchymal transition and cancerstem cells⁃like properties areinvolved in miR⁃148a⁃mediated anti⁃metastasis of hepatocellularcarcinoma[J].Mol Carcinog,2014,53(12):960⁃990. [40]　Aprelikova O,Palla J,Hibler B,et al.Silencing of miR⁃148a incancer⁃associated fibroblasts results in WNT10B⁃mediatedstimulation of tumor cell motility[J].Oncogene,2013,32(27):3246.[41]　Xu X,Fan Z,Kang L,et al.Hepatitis B virus X protein repressesmiRNA⁃148a to enhance tumorigenesis[J].J Clin Invest,2013,123(2):630⁃645.[42]　Wensveen FM,Alves NL,Derks Ingrid AM,et al.Apoptosisinduced by overall metabolic stress converges on the Bcl⁃2familyproteins Noxa and Mcl⁃1[J].Apoptosis,2011,16(7):708⁃721.[收稿2018⁃09⁃11　修回2018⁃12⁃03](编辑　张晓舟)。

miR-148a-3p抑制NRAS表达调控乳腺癌细胞增殖与凋亡的机制李杨;张季;杨思原;谢琳【摘要】目的探讨miR-148a-3p在乳腺癌中的作用及可能的机制.方法根据人乳腺癌细胞株-7(MCF-7)细胞是否转染及是否存在miR-148a-3p的模拟物分为3个组:未转染组、miR-148a-3p对照组和miR-148a-3p转染组.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测转染后miR-148a-3p在各组的信使RNA(mRNA)水平,运用四唑盐比色法(MTT)比较MCF-7细胞在3组的增殖情况,应用RT-qPCR检测各组神经母细胞瘤病毒性ras致癌因子的同原体(NRAS)的基因水平,应用Western blot 检测各组RAS病毒致癌基因同源物NRAS的蛋白水平,应用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与NRAS之间的作用.结果过表达miR-148a-3p显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7的增殖(P＜0.05),促进其凋亡(P＜0.05),降低NRAS基因和蛋白的表达(P＜0.05),双荧光素酶报告基因实验证明NRAS是miR-148a-3p的直接作用靶点.结论 miR-148a-3p可能通过靶向NRAS抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,促进细胞凋亡.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)023【总页数】4页(P3028-3031)【关键词】乳腺肿瘤;MCF-7;细胞增殖;细胞凋亡;miR-148a-3p;ras致癌因子的同原体【作者】李杨;张季;杨思原;谢琳【作者单位】云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院肿瘤内科,昆明650118;云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院乳腺科,昆明650118;云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院乳腺科,昆明650118;云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院肿瘤内科,昆明650118【正文语种】中文【中图分类】R737.9乳腺癌(BC)每年约有130多万新发病例和45万死亡病例[1]，是导致女性死亡的主要原因。

MiR-148a对乳腺癌生物学行为的影响及机制研究MicroRNAs(miRNAs)作为一种非编码RNA,通过靶向调节肿瘤相关基因的表达参与肿瘤的发生和发展。

新近的研究发现miR-148a在多种肿瘤中表达水平很低,并且被证实具有抑制肿瘤的功能,但是其在乳腺癌癌变过程中的确切作用,尚不完全明确。

本研究从离体实验和在体实验两个方面对miR-148a在乳腺癌中的功能进行了探索,发现乳腺癌中低表达的miR-148a能有效抑制乳腺癌细胞的增殖和耐药能力。

随后通过miRNAs生物信息学软件分析预测发现抗凋亡基因BCL-2(B cell lymphoma/leukemia-2)可能是miR-148a作用的直接下游靶点,并通过双荧光素酶报告基因实验进行了证实。

BCL-2是一个非常著名的癌基因,其主要通过抑制细胞凋亡促进肿瘤发生,并且目前研究已经证实BCL-2的过表达能显著抑制乳腺癌细胞的凋亡,促进乳腺癌细胞的生长和体内成瘤。

最后我们在转染了 BCL-2过表达质粒的乳腺癌细胞中共同转染miR-148a,发现原本受到抑制的凋亡有所恢复,所对应的细胞增殖能力也受到了削弱。

因此,我们的研究发现miR-148a通过靶向癌基因BCL-2来调控乳腺癌细胞的凋亡水平和增殖能力,在乳腺癌进展中发挥了负性抑制作用,这些数据强烈地提示miR-148a有可能成为乳腺癌治疗的又一个新的靶点。

研究真核生物启动子结构与功能的方法研究启动子结构与功能的方法主要有缺失、点突变和足迹法。

在分析得到了启动子的功能序列后，还要弄清与之结合的蛋白质及两者间的相互作用。

在研究真核生物启动子的结构与功能时，常采用下列方法。

（1）卵细胞系统（oocyte system）该方法是将DNA直接注射人爪蟾卵细胞的细胞核，分析和观察RNA的转录情况。

该方法的局限性在于试验条件受卵细胞内条件的限制。

可以用来分析：DNA片段的特性，不能用于分析蛋白质因子与DNA间的结合。

（2）转染系统（transfection system）将外源DNA导人转染的细胞并使之表达。

表达可分为瞬时表达（transient expression）和整合表达（integrant expression）。

由于转录是在细胞内完成的，可以看成是一种体内试验系统。

但外源基因又不是细胞所固有的，和细胞固有基因的表达尚有差别。

使用多种宿主细胞，可提高该系统的应用价值。

（4）转基因系统（transgenic system）转基因系统将外源基因整合人动物的生殖细胞，使外源基因在部分或全部组织中表达。

该系统和转染系统有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷贝存在，整合的位置也和内源性基因不同。

（4）体外转录系统（in vitro system）体外转录系统是一种经典的方法。

它应用体外转录的方法，结合缺失突变和点突变，来筛选哪些序列是启动子的功能所必需的，哪些序列对启动子的功能有影响，以及哪些辅助因子对启动子或启动子中的某一片段有何种作用。

启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度。

主要方法是用缺失试验来确定启动子的上游边界，即当缺失影响转录始时，说明该处就是启动子的上游边界；用缺失试验结合重组试验来确定下游边界。

确定了启动子的位置后，可采用点突变来研究每个碱基在启动子中所起的作用。

研究蛋白质辅助因子与DNA（启动子）的相互作用可采用DNase、足迹法、凝胶阻滞法和硫酸二甲酯方法等。

miR-148a抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭
张乾;张晓;赵洁
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2017(037)003
【摘要】#
【总页数】3页(P402-404)
【作者】张乾;张晓;赵洁
【作者单位】山东大学第二医院急诊科,山东济南250033;中国重汽医院内科,山东济南250031;山东大学第二医院急诊科,山东济南250033
【正文语种】中文
【中图分类】R734
【相关文献】
1.miR-148a对肝癌细胞株侵袭和迁移的抑制作用及机制
2.异丙酚下调PKM2抑制人肺腺癌细胞系增殖、迁移和侵袭
3.miR-148a靶向HMGB3抑制非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭和增强顺铂抗肿瘤效应的机制研究
4.miR-520c-3p靶向
Rab22a抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭的研究5.SP13786通过CAFs外泌体抑制Stat3-EMT影响肺腺癌细胞A549的迁移侵袭
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

真核生物反式作用元件真核生物反式作用元件（cis-regulatory elements）是一类在真核生物基因组DNA中具有调控功能的序列，主要用于调控基因的转录水平。

它们位于基因的上游区域，可以增强或抑制基因转录，以实现特定时间和空间上的基因表达。

本文将介绍真核生物反式作用元件的分类和功能，以及它们在生物体发育和适应中的重要作用。

真核生物反式作用元件主要包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）、终止子（terminator）和转录抑制子（silencer）等几种类型。

启动子位于基因的上游区域，介导RNA聚合酶II的结合和基因的转录起始。

它通常包括核心启动子（core promoter）和邻近启动子（proximal promoter）两个部分。

核心启动子包含转录起始位点（transcription start site），用于招募转录因子和RNA聚合酶II的结合。

邻近启动子则包括一系列调节序列，如TATA盒（TATA box）、CCAAT盒等，用于招募其他转录因子。

增强子位于基因的上游或下游区域，可以远距离调控基因的转录。

它们可以与核心启动子和邻近启动子形成DNA环状结构，使得转录因子和RNA聚合酶II得以合作。

增强子通常包括多个转录结合位点（transcription factor binding sites），用于招募转录因子。

它们可以通过转录因子的结合与其他反式作用元件相互作用，形成复杂的调控网络。

增强子的位置和数量对基因表达的调控程度有重要影响。

近年来的研究发现，多个增强子可以同时调控一个基因，形成动态、时间和空间上的基因表达模式。

终止子位于基因的下游区域，用于标记转录终止位点。

它能够与RNA 聚合酶II和RNA剪接复合体相互作用，实现基因转录的终止。

终止子通常包括多个序列元件，如多聚腺苷酸（polyadenylation signal）和剪接位点（splicing sites）。

1.启动子:是转录时RNA聚合酶结合的位点，是位于基因编码区的一段DNA，与RNA聚合酶结合后起始mRNA合成的序列。

2.复制起始位点：是DNA复制的起点,是带动目的基因复制的3.起始密码子：是位于mRNA上的，是翻译开始的地方,其本质是RNA4.转录起始点：转录时，RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基,通常为一个嘌呤。

5.一般启动子位于转录起始点上游,具体位置关系如下：a.真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子.b.RNA聚合酶I负责转录的rRNA基因,启动子（I类）较单一，由转录起始位点附近的两部分序列构成。

第一部分是核心启动子，由—45-+20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。

另一部分由-170——107位序列组成，称为上游调控元件,能有效地增强转录效率.c.RNA聚合酶Ⅲ负责转录的是5SrRNA、tRNA和某些核内小分子RNA(snRNA），其启动子（Ⅲ类）组成较复杂，又可被分为三个亚类.两类5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子,位于转录起始位点的下游，都由两部分组成。

第三类启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游.d.RNA聚合酶II负责转录的II类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snRNA基因,后者的启动子结构与III类基因启动子中的第三种类型相似.编码蛋白质的II类基因启动子在结构上有共同的保守序列，多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列,通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定,也有一些II类启动子不含有TATA盒,这样的启动子称为无TATA盒启动子。

6.原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列-35区和-10区组成，位置关系：—35区，-10区与—35区之间的间隔，—10区，间隔，转录起始位点。

miRNA-148a在上皮间质转化及肝癌转移中的作用
及意义的开题报告
研究背景：
肝癌是一种常见且具有高度侵袭性和转移率的恶性肿瘤。

其中，上
皮间质转化（EMT）是一种关键的过程，它使肝癌细胞从上皮细胞向间充质细胞转变，从而促进其转移和侵袭。

miRNA-148a作为一种miRNA可
以参与肝癌的发生发展，但对miRNA-148a在肝癌中参与EMT和转移的
作用和意义的研究尚不充分。

研究目的：
本研究旨在探究miRNA-148a在肝癌中参与EMT和转移的作用及意义，为肝癌的诊断和治疗提供新的靶点。

研究方法：
1.通过实时定量PCR检测miRNA-148a的表达水平；
2.利用分子生物学实验（Western blot, Transwell, Wound healing等）检测miRNA-148a的作用；
3.通过临床病理分析相关样本的miRNA-148a表达及其与EMT和转
移的关系。

研究预期结果：
1.明确miRNA-148a在肝癌中的表达及其与肝癌恶性程度的关系；
2.探究miRNA-148a通过参与EMT调节肝癌细胞转移的分子机制；
3.筛选miRNA-148a干预肝癌EMT及转移的潜在靶点。