Enlight有效解决Western Blot发光时发生荧光“淬灭”的问题

收藏贴！史上最全的WesternBlot常见问题和解决⽅案合集原理Western Blot以组织或细胞中的蛋⽩质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。

以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的⼀抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的⼆抗起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。

该技术⼴泛应⽤于定性检测蛋⽩⽔平的表达。

本⽂总结了Western Blot实验中常见的问题与解决⽅案，希望对⼤家有⽤，当然有描述不恰当的地⽅，欢迎批评指正。

⼀、 Western Blot的操作流程⼆、WB操作过程中常见问题和解决⽅案（1）样本问题问题：蛋⽩浓度太⾼或者盐浓度太⾼；解决：稀释样本，减少上样量或者降低盐浓度（2）转膜问题问题：转膜强度太强，导致⽬的位置上⽅的杂带太强解决：降低转膜强度（时间和电流），使⽬标蛋⽩上⽅的蛋⽩少转移到膜上。

问题：转膜⽓泡解决：A.转膜过程中尽量去除⽓泡，使膜，滤纸和胶紧密结合；B.抗体孵育的过程中，保持膜的充分浸润。

（3）胶的问题问题：泳道部分弯曲；解决：可能是胶的问题；可能是上样时多余的胶孔未⽤1x loading buffer补齐（4）⼆抗选择问题问题：⼆抗选择问题；解决：如果这种膜还在，没有⼲过，⽤1XTBST洗涤5min/3次，然后从封闭开始，重新WB接下去的步骤。

（5）抗体稀释度问题问题：杂带多，背景⼤；解决：降低上样量，增加⼀抗的稀释⽐。

（6）曝光问题问题：条带中间显⽩，可能⼀抗或⼆抗加⼊过多；上样过多，导致中间底物消耗过快，结束之后不发光解决：增加ECL的稀释度，减少上样量，增加⼀抗的稀释度。

（7）ECL液问题问题：ECL显⾊过程中荧光淬灭过快；解决：根据ECL液的特性，尽快选择显⾊（有些ECL液需要混匀孵育⼏分钟后才能达到最优的效果）（8）条带粘连问题：条带粘连；解决：上样量太多，减少上样量；制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。

Western Blot常见问题及处理Western印迹要想做的好，每个步骤都不能马虎，细节决定成败！做的过程中自己要多总结，用心去体会，失败不可怕，可怕的是不去总结经验和教训，成功都是从不断的失败中得来的。

注意事项：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.加水液封时用100ul的枪,缓慢均匀的加,以免产生胶不均匀.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气泡和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min) .加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对pvdf膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.否则一旦弄错先后顺序会很麻烦的。

转膜前1-2个小时-20°预冷转膜液，特别是新鲜配的转膜液。

预冷后转膜效果较好。

转膜液可以重复利用，每次用的时候再加点甲醇就可以了。

转膜时，一定要将三明治各层之间的气泡赶干净，否则转膜时产热量会很大，很影响转膜效率。

离心管装满水放-20°冻好，放在转膜液中降温。

转膜完，可以通过预染marker看看转膜的情况。

有没有转过了穿到膜后的滤纸上，或者还有部分残留在胶上。

以便下次调整转膜时间和电压。

二抗浓度不宜太高否则会导致背景过高.常见问题：1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因3的现象。

在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。

如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。

其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。

如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。

原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。

western显影时荧光淬灭太快原因及对策降低二抗浓度，然后这样做：在一张保鲜膜上面把NC膜铺上去，然后直接在NC膜上加入发光液（可以是理论量的一半，否则后面盖上膜后会溢的到处都是），不要吸干直接将保鲜膜盖上拿去显影，可以托比较长的时间（当然，淬灭的主要原因是单位面积上HRP的高度密集，使NC膜上残留的发光液被高速消耗，所以上面这个方法的原理就是降低NC膜单位面积上HRP的密度，同时提供尽可能多的发光反应液，使反应不会在短时间内结束——但是即便如此还是建议尽快压片！）在显影底物用到快见底的时候，我也遇到过这样的情况，后来用新的一瓶又持续发光超长时间，所以推测是显影底物不行了。

哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合）1.保鲜膜的质量。

a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。

ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。

在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。

b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。

目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。

如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。

2.ECL孵育结束后膜需要控干。

中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。

一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。

某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。

Western blot发光检测中常见的问题及解决方法免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。

其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。

拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。

在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。

大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。

ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。

图1 ECL检测原理图Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。

现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：1.目的蛋白信号弱或无。

在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。

首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。

Western Blot中的三大问题摘要：想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。

常遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，请看本文的问题解答。

Q:我的结果是膜上一片空白，为什么呢?A:导致这种结果的因素很多。

胶和膜放反了：如果在转印的过程中，胶和膜的位置颠倒了，那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中，而不会到达膜上。

对于标准的转印，凝胶应靠近三明治的负极，而膜对应正极。

转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。

一般来说，蛋白越大，转移的越慢。

转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。

而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。

避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。

如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。

如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。

在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。

为了帮助你直接监控转印效率，Bio-Rad也提供了多种预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。

试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。

底物应储存在-20℃。

抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。

过犹不及，太多的抗体也会阻碍抗原与抗体的结合。

一般的原则是以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。

Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。

酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。

不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。

叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。

另外，只能使用蒸馏的去离子水。

使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF 膜上的目的蛋白。

*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。

这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因3的现象。

在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。

如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。

也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。

其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。

如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。

原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。

westonblot原理-回复Westonblot原理，也被称为Western blotting或Immunoblotting，是一种常用的蛋白质分析技术。

它是在蛋白质电泳和蛋白质免疫检测的基础上发展起来的。

通过该技术，研究人员可以检测特定的蛋白质在一个复杂的混合物中的存在与否，并研究其表达水平和特性。

本文将逐步回答关于Westonblot原理的问题，帮助读者理解这一技术的原理和操作步骤。

第一步：蛋白质电泳Westonblot技术的第一步是蛋白质电泳。

在这一步骤中，研究人员首先将待测样品进行蛋白质提取，并用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行分离。

SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离技术，通过对蛋白质样品进行电泳，可以将不同大小和电荷的蛋白质分离开来。

这样，研究人员就可以得到不同的蛋白质带，使得后续的免疫检测更加准确和方便。

第二步：蛋白质转移蛋白质转移是Westonblot技术的关键步骤。

在这一步骤中，研究人员将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到一块膜上。

通常使用的膜是聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜。

在转移过程中，蛋白质会因为电场的作用而从凝胶中移至膜上。

转移有两种常用的方法：湿式转移和半湿式转移。

湿式转移使用缓冲溶液将蛋白质转移到膜上，而半湿式转移则通过吸力将蛋白质转移至膜上。

蛋白质转移的时间和电压会根据不同实验的需要而有所调整。

第三步：蛋白质定位转移完成后，研究人员需要将感兴趣的目标蛋白质定位在膜上。

蛋白质在膜上的定位是通过特异性的免疫反应实现的，即蛋白质与特异性抗体结合。

为了防止非特异性结合，通常需要在蛋白质定位前进行一个阻断步骤，即使用牛血清蛋白（BSA）或非脂肪奶粉等阻断蛋白质结合位点。

阻断步骤完成后，膜会与含有特异性抗体的抗体溶液一起孵育，以便特异性抗体与目标蛋白质结合。

研究人员可以使用单克隆抗体或多克隆抗体进行免疫反应，这样可以增加检测的特异性和准确性。

第四步：蛋白质检测蛋白质定位后，研究人员需要进行蛋白质检测。

SDS-PAGE电泳、western blotting 过程中常见问题以及解决方法SDS,PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS,PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论: Q:SDS,PAGE电泳的基本原理,A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式:logMW=K-bX，式中:MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响,A:在SDS,PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris,HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris,甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

Western Blot 常见问题分析8 t W5 _0 U6 |: U, ]$ b; d) O1. 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解释一下二者在使用中的区别？; e2 Q8 R, H& o! @1 A4 u: @选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。

PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。

但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。

: Y0 g" l9 S) O' p8 uwestern blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。

6 p) e4 c- U: n/ i/ E; |2. 没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？1 r' @. k n/ J不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。

# Y8 y5 S% t, g4 d6 ^+ w3. 做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？; u5 D* p- |: O0 ?9 D最好还是不要同时加两种一抗。

因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。

做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

+ B% W1 U3 c' C2 O; O4. western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？" m) ~/ c) t4 `! h4 ]* W5 HPVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。

WesternBlot常见问题及处理总结免疫细胞研究wesｔｅrn blotＷestｅｒn Blｏｔ常见问题及处理总结阿木１、wesｔern ｂｌoｔ得优点答: 灵敏,可达ｎg级,用Ｅcl显色法理论上可达pg 级、方便,特异性高。

２、为什么我得细胞提取液中没有目标蛋白？答: 原因有很多: a)您得细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 您得细胞中得蛋白质被降解掉了,您必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c)您得抗体不能识别目标蛋白,多瞧瞧说明,瞧就是否有问题。

3、我得细胞提取液有得有沉淀,有得很清亮,为什么呢？答: a)有沉淀可能因为您得蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长, b) 也不排除您得抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。

４、我做得蛋白质分子量很小(10KＤ),请问怎么做WＢ?答:可以选择0。

2μml得膜,同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起,再转移、其她按步骤即可。

5、我得目得带很弱,怎么加强？答:可以加大抗原上样量、这就是最主要得、同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏,有什么解决方法? 答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度、７、目标带就是空白,周围有背景,就是为什么？答:您得一抗浓度较高,二抗上HＲP 催化活力太强,同时您得显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。

将一抗与二抗浓度降低,或更换新底物。

8、我得胶片就是一片空白,就是怎么回事？答:如果能够排除下面得几个问题那么问题多半出现在一抗与抗原制备上。

ａ)二抗得HRP 活性太强,将底物消耗光;b)ECM底物中H２O2,不稳定,失活;ｃ) ＥCＬ底物没覆盖到相应位置;d) 二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟与5分钟后,底片漆黑一片,就是什么原因呢？答:ａ)可能就是红灯造成得, 胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗得情况下操作.瞧就是否有改善、;ｂ) 显影时间过长。

western显影时荧光淬灭太快原因及对策降低二抗浓度，然后这样做：在一张保鲜膜上面把NC膜铺上去，然后直接在NC膜上加入发光液（可以是理论量的一半，否则后面盖上膜后会溢的到处都是），不要吸干直接将保鲜膜盖上拿去显影，可以托比较长的时间（当然，淬灭的主要原因是单位面积上HRP的高度密集，使NC膜上残留的发光液被高速消耗，所以上面这个方法的原理就是降低NC膜单位面积上HRP的密度，同时提供尽可能多的发光反应液，使反应不会在短时间内结束——但是即便如此还是建议尽快压片！）在显影底物用到快见底的时候，我也遇到过这样的情况，后来用新的一瓶又持续发光超长时间，所以推测是显影底物不行了。

哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合）1.保鲜膜的质量。

a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。

ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。

在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。

b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。

目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。

如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。

2.ECL孵育结束后膜需要控干。

中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。

一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。

某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。

[1]各位朋友：请教关于SDS—PAGE的问题。

我的配胶体系如下:15%分离胶4%浓缩胶水2.3ml2.7ml30％丙烯酰胺5。

0ml 0。

67mlTris—HCL PH8。

8 2。

5ml PH6.8 0.5ml10％SDS 0.1ml 0。

04ml10％APS 0。

1ml 0.04ml TEMED 0。

004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd,浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min.跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因?我的试剂都是新配置的。

谢谢！！！答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶SDS—PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15％胶（毫升）： 5 －－10 －－15－－20－－30－－50 蒸馏水: 0。

5 －－ 1.0－－ 1.5 －－ 2.0 －－3。

0 －－5.0 30％Acr-Bis(29:1）: 2。

5 －－5。

0 －－7.5 －－10。

0 －－15。

0－－25.0 1M Tris, pH8。

8: 1.9－－3。

8 －－5.7－－7.6－－11。

4 －－19。

0 10%SDS ：0。

05－－0.1－－0。

15 －－0.2－－0。

3－－0.5 10％过硫酸铵：0.05 －－0.1 －－0.15－－0。

2 －－0.3 －－0.5 TEMED：0。

002－－0.004 －－0。

006 －－0。

008 －－0.012 －－0.02 配制不同体积4%胶SDS—PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升) 4%浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水： 3.16ml40％Acr/Bic（37。

5：1）: 0。

5ml0。

5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）：1.26ml10％SDS ：50 微升μ微升μ10％AP(过硫酸胺）：25 TEMED ：5 微升μ加TEMED后，立即混匀即可灌胶.【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要.如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。