猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

猪支原体肺炎的实验室诊断方法作者：文友君文水英来源：《现代畜牧科技》2017年第10期摘要：猪支原体性肺炎又称猪喘病或地方性流行性肺炎，是猪特有的一种接触性传染病。

该病由呼吸道的飞沫传染，多为慢性经过，主要临床症状是咳嗽和气喘，而体温和食欲一般没有明显的变化。

虽然该病的死亡率不高，但由于流行的广泛性、长期性和消耗性，所导致的经济损失又是巨大的，对集体养猪和机械化养猪业的迅速发展威胁较大，所以对该病进行及时的诊断很有必要。

关键词：猪；支原体肺炎；诊断；鉴别中图分类号：S858.28 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2017）10-0130-011 猪肺炎支原体的分离与鉴定形态特征：用病猪肺炎病灶直接触片或用培养物涂片检查，如发现以环状为主的多态形微生物即可初步认为是该病的病原体。

培养特性：将病肺接种于无细胞培养基中，连续传代几次后，可见pH值改变并有轻微混浊。

经涂片染色镜检，见有猪肺炎支原体特异形状的菌体时即可作出阳性判定。

致病性测定：将无细胞培养物接种健康仔猪，如出现典型喘病者，即为猪支原体肺炎。

代谢抑制试验：有人进行了初步试验，将猪肺炎支原体注射于家兔进行高度免疫后，取其血清加入培养物中能抑制pH值的变化，这是一种简便的特异诊断法。

生长抑制试验：据报道，有人将制好的抗猪支原体肺炎血清的干燥圆纸片，放在接种菌体的平皿内培养1～2周后，在低倍显微镜下观察其生长抑制情况，如抑制圈大于1 mm者即为猪支原体肺炎。

2 血清学诊断法近年来对该病的血清学诊断方法，诸如补体结合试验、微量补体结合试验、琼脂扩散试验、琼脂明胶电泳试验、酶联免疫吸附试验、生长沉淀试验、凝集试验及荧光抗体技术等虽已有试验报告，但还没达到实用程度，现介绍两种简单方法，供诊断时参考。

微粒凝集试验：据报道，将病猪血清与猪肺炎支原体按一定比例混合后，在恒温箱中培养24～48 h，取出染色镜检，发现有菌体凝集者即为阳性。

这种方法经过初步试验，认为既可作为猪场传染病的普查，又可以鉴定支原体种属。

收稿日期：2010－01－16基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻0537008－3B ）作者简介：张红云（1984－），女，陕西韩城人，硕士研究生，主要从事动物传染病与分子病毒学研究工作。

*为通信作者，E－mail ：tingrongluo＠gxu．edu．cn 。

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine ，MPS ）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumo-niae ，Mhp ）引起猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病。

MPS 广泛分布于世界各地，猪感染后导致生长发育不良、生长率和饲料转化率降低，且易引起继发性病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。

自1965年Mare 等［1］发现Mhp 以来，国内外学者先后通过培养基分离获得Mhp 。

虽然Mhp 可在人工培养基上生长，但对营养要求极为苛刻，且培养时间长［2］，以此进行临床诊断意义不大。

由于MPS 对养猪业影响较大，因此，对其进行早期快速诊断成为研究工作的重中之重。

经过临床实践证明，应用间接血凝试验（IHA ）、补体结合试验（CFT ）、酶联免疫吸附试验（ELISA ）、免疫荧光试验（IF ）及免疫酶试验（RIDEA ）等血清学方法进行MPS 诊断时，以ELISA 方法效果较为理猪肺炎支原体PCR 检测方法的建立及初步临床应用张红云1，梁晶晶1，李回1，孟先明1，潘艳1，2，冯励1，2，罗廷荣1，2*（1广西大学动物科学技术学院，南宁530005；2广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，南宁530005）摘要：根据GenBank 中猪肺炎支原体（Mhp ）J 株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物，建立了快速检测Mhp 的PCR 方法。

该方法能扩增出948bp 的Mhp 特异性条带，其敏感性达到可检测出0．735ng 的Mhp DNA ，但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带；将克隆获得的目的片段与GenBank 已发表的Mhp J 株的P36基因进行比较，同源性达到99．9％。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用刘茂军;王占伟;韦艳娜;马庆红;杨莉莉;周勇岐;邵国青【摘要】根据猪肺炎支原体（Mhp）和猪鼻支原体（Mhr）的16S rRNA基因设计3条引物,建立Mhp和Mhr的双重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。

应用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。

结果显示,该方法具有良好的特异性,最低可检测到0.66 ng的Mhp基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA。

临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。

该双重PCR 方法可用于Mhp与Mhr的鉴别、诊断以及疫苗纯粹性检查,快速而准确。

%According to the 16S rRNA gene of Mycoplasma hyopneumoniae(Mhp) and Mycoplasma hyorhinis(Mhr),we designed three primers and established a double PCR method for simultaneous detecting Mhp and Mhr,and the specificity and sensibility assay of the method were performed.The clinical samples and vaccine sample were detected by the method.The results showed that the specific DNA fragment could be amplified from Mhp and Mhr,and the minimum detection limit could reach to 0.66 ng of Mhp genome DNA and 0.58 ng of Mhr genome DNA.The results of clinical samples and vaccine samples test with the double PCR were consisted with that by the normal PCR.Therefore,the double PCR method is a fast and accurate method for the detection and diagnosis of Mhp and Mhr.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)009【总页数】4页(P7-10)【关键词】猪肺炎支原体;猪鼻支原体;PCR;检测【作者】刘茂军;王占伟;韦艳娜;马庆红;杨莉莉;周勇岐;邵国青【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014 南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014【正文语种】中文【中图分类】S859.797猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)的主要病原，该病又称猪气喘病或猪地方流行性肺炎(EPP)，是一种猪的慢性呼吸道传染病，在全世界广泛存在，长期以来被认为是最常发生和经济意义重大的猪病之一。

猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用文章标题：猪附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用在农业领域，猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用备受关注。

本文将从建立方法的过程、应用范围和未来发展等方面进行深入探讨，帮助读者全面了解这一重要的技术。

一、建立方法的过程1.1 猪附红细胞体PCR检测方法的原理猪附红细胞体PCR检测方法是一种基于多重PCR的检测技术，主要用于检测猪体内的特定病原体。

1.2 关键步骤和技术要点建立这一检测方法需要充分理解猪体内病原体的生物学特征，同时需要在PCR技术上进行优化，确保灵敏度和特异性。

1.3 方法的验证和实验数据经过大量实验和数据对比，可以确定该方法在猪体内病原体检测方面具有可靠性和准确性。

二、初步应用2.1 在疾病防控中的应用猪附红细胞体PCR检测方法可以用于疾病的早期诊断和监测，为疾病的控制和防治提供重要支持。

2.2 在饲养管理中的作用通过该方法的应用，可以及时检测病原体，避免疾病的传播，保障猪的生长和健康。

2.3 对农业生产的意义猪附红细胞体PCR检测方法的建立和应用，对农业生产具有重要意义，可以提高疾病检测的精准度，保障畜禽健康生产。

三、未来展望3.1 技术的改进和完善在未来，需要不断改进和完善猪附红细胞体PCR检测方法，提高其在现实应用中的效率和稳定性。

3.2 拓展应用领域除了用于猪体内病原体的检测，该技术还可以在其他动物的病原体检测中得到拓展，具有广阔的应用前景。

3.3 国内外研究现状与竞争优势通过了解国内外研究现状，可以为我们提供更多的启发和借鉴，提高我们的研究水平和竞争力。

个人观点和总结通过对猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用的深入探讨，我认为这一技术具有巨大的潜力和应用前景。

在未来，随着技术的不断改进和完善，相信它将在农业生产和疾病防控领域发挥更大的作用。

在撰写本文的过程中，我深刻理解了猪附红细胞体PCR检测方法的重要性和价值所在。

常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒(蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、病料的处理取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。

2、RNA的提取1取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。

2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g 离心15 min。

离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动静置10分钟,4℃12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振摇,将白色沉淀悬浮,4℃7500g离心5 min。

弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20μLDEPC 水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。

两步法:1、反转录在10μL的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、0.5μL或者下游引物0.5μL;65℃10分钟, 10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV 100U/μL 0.25μL(反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。

2、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立研究摘要猪呼吸道病综合征是一种多因子性疾病。

通过设计1对针对16s rDNA的引物，建立了该病原的PCR检测方法，该方法能从标准株和分离株中获得阳性扩增，但不会与其他种类支原体或者是猪呼吸道中的常见微生物发生交叉反应。

为证实扩增产物的特异性，对2个PCR产物进行纯化、测序和序列分析，证实为肺炎支原体。

关键词猪肺炎支原体；PCR；检测方法；建立猪支原体肺炎即猪地方流行性肺炎（swine enzootic pne-umonia），俗称猪喘气病。

因其病原为霉形体，又称猪霉形体肺炎（mycoplasma hyopneumoniae M. suipneumoniae）[1]。

猪支原体肺炎是一种慢性呼吸道传染病，除了能引起猪地方流行性肺炎外，也是猪呼吸道疾病综合征的一种原发性病原[2]。

该病自然感染仅见于猪，引起猪地方流行性肺炎。

病猪生长发育迟缓，饲料转化率低，抵抗力下降；另外，支原体肺炎可继发多种疫病，如PRRS、圆环等，这些疫病的病原体均可损伤、破坏肺泡的巨噬细胞和淋巴细胞，造成免疫抑制，从而导致多种疫苗接种失败[3-5]。

此外，猪喘气病还易与其他疫病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发，造成更大的危害。

猪肺炎支原体病能对养猪业造成重大经济损失，是最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。

鉴于该病对规模化养殖场危害较大，而常规的病原分离检测方法耗时长，对控制疫病的流行以及把握最佳治疗时间不利，且猪肺炎支原体的抗原与猪体内的其他支原体如猪絮状支原体、猪鼻支原体、滑液支原体存在交叉反应，利用传统的病原分离和ELISA很难加以区分。

因此，建立一种快速、准确、简便、灵敏度高、特异性强的方法就显得尤为重要。

本试验根据GenBank中的Mhp 16s rRNA 基因设计引物，扩增出1个大小为649 bp的特异性片段。

经克隆并测序表明，与GenBank中Mhp序列的同源性为100%。

而对于常见的猪呼吸道疾病有关的病原猪鼻支原体、支气管败血波氏杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌以及鸡毒支原体则不能扩增出特异性片段，表明该引物具有高度的特异性，从而可以为猪肺炎支原体病的快速诊断提供理论依据。

福建畜牧兽医第43卷第6期2021年猪支原体肺炎I gA抗体ELI S A检测方法的建立及应用朱海侠陈雷傅星源潘小慧李枭辰饶云萍渊兆丰华生物科技渊福州冤有限公司福州350014冤摘要为更好地了解猪群猪肺炎支原体感染或免疫情况袁本研究将猪肺炎支原体168株P97R1基因序列连接至PET-32a载体中进行诱导表达袁经SD S-PA G E和W es t er n Bl ot鉴定后袁获取重组蛋白袁将重组蛋白作为包被用抗原建立检测猪鼻拭子中M hp I gA抗体的间接ELI SA方法遥结果显示袁经诱导表达成功获取大小约35kD a可溶性表达的重组蛋白袁该蛋白能与H i s标签抗体发生特异性结合遥采用重组蛋白作为包被用抗原建立的ELI SA方法优化结果显示院重组蛋白的最佳包被浓度1.0ug/m L袁待检样品最佳稀释比例为1:25袁该方法特异性好尧灵敏度高袁与临床实际情况以及PC R检测结果具有很好的符合度遥结论院采用构建的P97R1重组蛋白包被抗原建立的I gA抗体检测方法具有很好的特异性和灵敏度遥关键词猪肺炎支原体诱导表达I gA抗体文献标识码院A文章编号院1003-4331渊2021冤06-0016-05E st abl i shm ent and appl i cat i on of E L ISA f or M ycopl as m alpneum oni a IgA det ect i onZhu H ai xi a Chen Lei Fu X i ngyuan Pan X i aohui LiX i aochen R ao Y unpi ng渊Jof unhwa Bi ot echnol ogy(Fuzhou)Co.,Lt d.,Fuj i an Fuzhou,350014冤A bst ract I n oder t o under s t and t he si t uat i on of pi gs i nf ect ed or i m m uni zed wi t h M ycopl asm a hyopneum oni ae.P97R1sequences of M ycopl asm a hyopneum oni ae168st r ai n was l i gat ed i nt o PET-32a vect or t o i nduce expr essi on.A f t er i dent i f i cat i on of t he pr ot ei n by SD S-PA G E and W es t er n Bl ot,i twas used t o est abl i sh i ndi r ectELI SA m et hod f or det ect i on I gA ant i body ofm ycopl asm alpneum oni a i n pi g nas al swab.The r esul t i ndi cat ed t hat t he r ecom bi nant pr ot ei n obt ai ned i n t he st udy was sol ubl e pr ot ei n about35kD a and i t can speci f i cal l y bi nd t o t he l abel ed ant i bodi es of H i s.The m et hod of i ndi r ect ELI SA showed t hat t he opt i m al coat i ng concent r at i on of r e鄄com bi nant pr ot ei n was1.0ug/m L,and t he opt i m al di l ut i on r at i o of t he sam pl e t o be det ect ed was1:25.The m et hod had good speci鄄f i ci t y and hi gh sensi t i vi t y,and had good consi st ency wi t h t he cl i ni cal si t uat i on and PCR r es ul t s.Concl usi on:t he m et hod of i ndi r ect ELI SA est abl i shed i n t he st udy has good s peci f i ci t y and sensi t i vi t y f or t he det ect i on ofM hp I gA ant i body.K ey w ords M ycopl asm alhyopneum oni ae I nduced expr ess i on The ant i body ofI gA猪支原体肺炎渊M ycopl asm al pneum oni a ofswi ne袁M ps冤又称猪气喘病袁是由猪肺炎支原体渊M y鄄copl as m al hyopneum oni ae袁M hp冤引起的一种慢性呼吸道疾病遥虽然该病死亡率低袁但发病率高袁世界各地均有流行[1]遥猪群感染该病后会引起机械性咳嗽袁日增重下降袁饲料报酬率降低等遥严重时袁当呼吸道黏膜纤毛屏障受到破坏后袁很容易继发感染其它病原菌袁导致猪只死亡遥在当前非洲猪瘟疫情形势严峻的大环境影响下袁猪价急速上涨袁如何在保证猪群不受非洲猪瘟侵袭的情况下迅速育肥尧出栏袁成为养猪业密切关注的问题遥目前对猪支原体肺炎的预防主要有药物和疫苗预防两种措施遥但在当前国家法规野禁抗冶的背景下袁疫苗免疫成为防控该病的关键遥研究表明[2]袁疫苗免疫在减轻因该病造成的肺部病变尧提高日增重和饲料转化率方面效果明显袁且对控制同群猪只感染尧降低母猪带菌率等非常重要遥当前针对猪支原体肺炎的疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活苗两种袁但灭活苗主要以体液免疫为主袁即使添加相关佐剂的灭活疫苗也只能产生有限的细胞免疫[3]袁猪支原体肺炎灭活疫苗不能阻止野毒的感染遥此外袁对猪肺炎支原体而言袁灭活疫苗诱导产生的抗体水平和阻止病原移行及疾病的发生联系不大袁只能作为一种参考性指标[4]遥猪支原体肺炎灭活疫苗免疫后由于不能阻止猪肺炎支原体野毒对支气管纤毛的定植袁因此袁无法产生完全的保护遥而免疫猪支原体肺炎活疫苗后袁能够有效地激活全身的细胞免疫和局部黏膜免疫[5]遥作为黏膜免疫系统的效应分子袁分泌型I gA在呼吸道尧胃肠道和泌尿生殖道的黏膜抗感染中发挥重要作用[6]遥特异性I gA的水平已经作为大多数研究中评估疫苗使用效果和早期疾病发生的主要依据遥P97蛋白是发现最早的M hp黏附蛋白袁也是最重要的一种毒力因子遥它包含R1和R2两个重复区域袁其中R1区是主要的抗原决定簇[7]遥在M hp感染早期袁血清和黏膜中均能检测到针对P97R1区的特异性抗体袁并已确定为猪肺炎支原体早期感染的血16. All Rights Reserved.福建畜牧兽医第43卷第6期2021年清学标志物[8]遥抗猪支原体肺炎I gA是M hp感染或免疫后在呼吸道首先产生的特异性标志袁同时也反映了疫苗免疫后的保护效果[9]遥本研究采用猪肺炎支原体P97R1蛋白作为包被用抗原袁通过建立猪支原体肺炎I gA抗体间接ELI SA检测方法袁结合现有的血清学尧病原学检测方法袁以期更好地用于评估免疫猪群M hp疫苗使用效果以及未免疫猪群的自然感染情况遥1材料与方法1.1菌种尧血清尧阴阳性肺泡灌洗液猪肺炎支原体渊168株冤活疫苗由本公司提供曰PR R SV尧PCV2尧CSFV尧PR V尧TG EV阳性血清由本实验室保存曰M hp 猪阴阳性肺泡灌洗液的制备参照文献[9]遥1.2主要试剂PET-32a原核表达载体由本实验室保存曰2伊Taq PC R M ast er M i x购自天根生化科技渊北京冤有限公司曰Pr i m eSt ar M ax pol ym er ase尧EcoR 玉尧H i nd芋限制性内切酶尧T4D N A连接酶购自宝生物工程渊大连冤有限公司曰大肠杆菌D H5琢袁t r ans et t a (D E3)购自北京全式金生物技术有限公司曰质粒提取试剂盒和D N A凝胶回收试剂盒购自M egan曰蛋白凝胶试剂盒购自博士德生物工程有限公司曰H i s融合蛋白纯化柱渊5m L预装柱冤购自上海七海复泰生物技术有限公司曰TM B显色液购自上海碧云天生物技术有限公司曰BSA购自Bi oshr ap曰羊抗猪I gA-H R P 购自Bet hl y玉遥1.3引物设计与合成参照文献[10]袁由上海生工生物技术有限公司合成遥1.4M hp P97R1基因的扩增以猪肺炎支原体渊168株冤菌株为模板袁用所合成的引物进行P97R1基因扩增遥反应体系院Pr i m eSTA R M ax pr em i x渊2伊冤25uL袁上下游引物渊20um/m L冤各1uL袁D N A1uL袁补足ddH2O至50uL遥PCR反应条件院98益预变性2m i n袁98益变性10s袁58益退火5s袁72益延伸5s袁30个循环曰72益延伸10m i n袁4益保存遥PCR产物用1.0%核酸凝胶电泳检测遥1.5PET32a-P97R1重组基因表达载体的构建利用D N A凝胶试剂盒对P97R1基因扩增产物进行纯化袁利用ECO R玉和H i d芋限制性内切酶对P97R1基因片段和PE T-32a载体进行双酶切袁利用T4D N A 连接酶对双酶切产物进行连接袁转化袁并对菌落进行鉴定和序列测定袁将鉴定为阳性的菌落进行质粒提取遥1.6P97重组蛋白的诱导表达尧纯化及鉴定将重组质粒转化t r anset t a渊D E3冤感受态细胞中袁挑取单菌落袁利用I PTG诱导剂进行诱导表达袁离心收集菌体袁收集的上清和菌体进行SD S-PA G E鉴定袁经W es t er n Bl ot鉴定正确的菌株经处理后用H i s融合蛋白纯化柱进行纯化遥1.7猪支原体肺炎I gA抗体间接ELI SA检测方法的建立及应用1.7.1P97R1蛋白最佳包被浓度及最佳阴阳性肺泡灌洗液稀释浓度的确定采用方阵滴定法袁将P97R1重组蛋白用碳酸盐缓冲液渊CBS袁pH9.6冤按照8ug/m L尧4ug/m L尧2ug/m L尧1ug/m L尧0.8ug/m L尧0.5ug/m L尧0.4ug/m L比例进行稀释后袁包被96孔ELI SA酶标板袁100uL/孔袁同时设置空白对照袁4益包被过夜遥PBST洗涤3次袁拍干袁加入一定量BSA 于37益作用一段时间曰洗涤袁拍干袁将阴阳性肺泡灌洗液按1:10尧1:20尧1:25尧1:30尧1:40尧1:50的稀释倍数进行稀释尧加样袁100uL/孔袁37益孵育一段时间后袁洗涤尧拍干袁加入一定浓度的羊抗猪I gA-H R P袁37益孵育一段时间曰洗涤袁拍干袁加入TM B显色袁室温作用10m i n曰加入2M H2SO4终止反应袁测定O D450nm 值袁以P/N比值最大的抗原包被浓度和样品稀释度为最佳的工作浓度遥1.7.2最佳包被条件的确定采用最佳的抗原包被浓度及阴阳性样品稀释倍数袁将酶标板包被抗原后分别置于4益过夜袁37益尧1h袁37益尧2h袁其它条件不变袁以P/N比值最大的包被条件确定为最佳包被条件遥1.7.3最佳封闭浓度及封闭时间的确定采用最佳的抗原包被浓度及阴阳性样品稀释浓度袁将酶标板分别用5%BSA尧4%BSA尧3%BSA尧2%BSA尧1%BSA进行封闭袁其它条件不变袁以P/N比值最大的封闭浓度确定为最佳封闭浓度袁并根据最佳封闭浓度确定最优的封闭时间遥1.7.4最佳一抗工作时间的确定采用最佳的包被条件袁将阴阳性样品进行一定浓度稀释后袁置37益分别作用30m i n尧45m i n尧60m i n袁其它条件不变袁以P/N比值最大的作用时间确定为最佳一抗工作时间遥1.7.5羊抗猪I gA-H R P最佳工作条件的确定采用最佳的包被条件袁将羊抗猪I gA-H R P按照一定稀释比例渊说明书推荐浓度冤稀释后分别在37益作用30m i n尧45m i n尧60m i n袁其它条件不变袁以P/N比值最大的作用时间确定为最佳二抗工作浓度和工作时间遥1.8临界值的确定用上述建立的方法检测52份临床鼻拭子样本渊阴性组冤袁测定O D450nm值遥根据统计学原理袁O D450nm逸X+3SD时袁判定为阳性曰O D450nm17. All Rights Reserved.福建畜牧兽医第43卷第6期2021年臆X+2SD时袁判定为阴性曰介于两者之间的判定为可疑[11]袁同时利用m edcal c软件分析R O C曲线袁最终确定其临界值遥1.9特异性试验按照建立的方法袁分别对PR R SV尧PCV2尧CSFV尧PR V尧PED V阳性血清样品进行检测袁根据O D450nm值袁确定上述建立方法的特异性遥1.10敏感性试验采用上述建立的间接ELI SA方法对不同稀释倍数的M Ps I gA阳性抗体进行检测袁确定该检测方法的灵敏度遥1.11M hp抗体ELI SA检测方法的应用为了解某猪群猪肺炎支原体感染情况袁选取已知试验场采集猪群鼻拭子袁并通过临床疫苗实际免疫情况袁结合M hp PCR检测方法对猪群M ps感染情况进行分析袁比较该抗体检测方法与猪群实际情况的符合率情况遥2结果与分析2.1P97R1基因的扩增以M hp168菌株为模板袁采用特异性引物对P97R1基因进行PCR扩增袁经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测袁结果显示扩增出大小为280bp的目的片段袁与预期结果一致渊见图1冤遥1院D L2000D N A M ar ker曰2院目的基因图1P97R1基因的P C R扩增2.2PET32a-P97R1原核表达载体的构建将PET32a载体与P97R1基因进行连接袁转化后袁利用PET32a通用引物对获取的菌落进行PCR鉴定及测序分析遥结果表明院获取预期结果已知的目的条带袁测序结果符合预期渊见图2冤遥2.3重组P97R1蛋白的诱导表达尧鉴定及纯化将重组质粒PET32a-P97R1转化至t r anset t a渊D E3冤中袁挑取单菌落袁经I PTG诱导4h后获得了可溶性表达蛋白袁其大小约为35kD a渊见图3冤遥使用H i s融合蛋白阳性血清作为一抗袁经W est er n Bl ot验证其为H i s 标签融合蛋白遥经H i s标签融合蛋白纯化柱进行纯化袁获取较高纯度的蛋白袁蛋白浓度为336ug/m L遥M院12-80kda蛋白M ar ker曰1院诱导前样品曰2院诱导后样品曰3院破碎后沉淀曰4院破碎后上清图3P97R1重组蛋白诱导表达分析2.4猪支原体肺炎I gA抗体间接ELI SA反应条件的优化通过方阵滴定试验袁确定其最优反应条件渊见表1冤遥2.5临界值确定52份M ps阴性猪鼻拭子O D450nm 的平均值为0.204袁标准差渊SD冤为0.081袁确定院当样品O D450nm值逸0.446判定为阳性曰当样品O D450nm值臆0.365判定为阴性曰当0.365<样品O D450nm<0.446判定为可疑遥R O C曲线结果显示袁在O D450nm臆0.365时具有较好的特异性和灵敏度遥2.6特异性试验结果表明袁本研究建立的间接M院D L2000D N A M ar ker曰1-3为菌落图2P97R1重组基因阳性菌落的鉴定18. All Rights Reserved.表1猪支原体肺炎I gA抗体E LI S A反应条件的优化摸索条件种类最优反应条件重组蛋白包被条件一抗工作条件最佳封闭条件最佳羊抗猪I gA-H R P工作条件的确定TM B显色时间1ug/m L袁37益作用2h1:20倍稀释袁37益作用45m i n 2%BSA袁37益封闭1h1:10000倍稀释袁37益作用60m i n室温作用15m i n表2猪支原体肺炎I gA抗体E LI S A检测方法特异性检测阳性样品阴性样品M ph PR R SV PCV2CSFV PR V PED V M phO D450nm 判定0.181阴性0.109阴性0.132阴性0.121阴性0.144阴性1.233阳性0.098阴性表3猪支原体肺炎I gA抗体E LI S A检测方法灵敏度检测项目样品稀释倍数1:101:201:251:301:351:401:451:50O D450nm 判定1.168阳性0.764阳性0.596阳性0.477阳性0.47阳性0.438可疑0.387可疑0.363阴性ELI SA方法与上述病原均无交叉反应袁具有良好的特异性渊见表2冤遥2.7敏感性试验应用上述建立的检测方法对不同稀释倍数的M hp阳性肺泡灌洗液进行检测袁结果显示当样品稀释至1:35时袁O D450nm值为0.47袁判定为阳性渊见表3冤遥2.8M hp抗体ELI SA检测方法的应用应用上述建立的方法对某试验场猪群的92份鼻拭子样品进行测定袁结果共计检出阴性样品73份袁阳性样品13份袁可疑样品6份遥对阳性样品尧可疑样品及部分阴性样品进行M hp检测袁结果发现袁阳性样品的鼻拭子中均存在M hp抗原袁可疑和阴性样品中无M hp 检出遥3讨论黏膜免疫是猪支原体肺炎活疫苗的免疫机制之一遥P97R1是M hp纤毛结合素P97蛋白氨基酸序列C末端的重复序列袁直接参与M hp对猪呼吸道黏膜上皮纤毛粘附并发挥粘附功能袁具有很强的免疫原性[12]遥华利忠等[13]指出袁无论是肺内免疫还是气溶胶免疫猪支原体肺炎活疫苗均能在一定时间内短暂诱导免疫猪上呼吸道的黏膜免疫袁为免疫猪提供早期保护遥SI gA作为黏膜免疫的主要指标袁也是病原体入侵机体后最先产生的抗体遥疫苗免疫后通过快速占位机制能够有效地阻止猪肺炎支原体野毒的入侵遥有报道指出袁支原体仅需1h就能大量粘附宿主细胞袁免疫后2h就能够在肺泡灌洗液中检测到毒株的存在遥本研究发现猪支原体肺炎I gA抗体阳性猪只鼻拭子中M hp检测基本为阳性袁阴性猪鼻拭子样品中均未检测到M hp的存在袁且免疫后猪鼻拭子中M hp存在时间达42d之久遥这一结果再次验证了猪支原体肺炎活疫苗渊168株冤免疫后能够长时间在呼吸道黏膜产生很好的占位效应袁且能够刺激机体产生很好的黏膜免疫反应遥针对猪支原体肺炎抗体的检测方法袁很多学者做了相关的研究[14]遥逯晓敏等[9]建立了抗猪支原体肺炎I gA间接ELI SA检测方法袁并将全菌和P97R1蛋白分别作为抗原进行对比分析袁指出全菌蛋白虽然包含了病原菌的全部抗原蛋白袁但其可能会与呼吸道其它支原体产生非特应性交叉反应遥本研究方法与该方法相比大大缩短了检验时间袁降低了检验过程的复杂性遥当前市面上存在的猪肺炎支原体试剂盒主要是针对血清中I gG抗体的诊断试剂盒遥而血清中I gG抗体水平的高低与动物的免疫保护情况并无相关性遥且研究表明[5]袁猪群免疫猪支原体肺炎活疫苗能够产生细胞免疫袁并不能激活机体体液免疫应答曰自然感染和免疫灭活苗的猪群则能够激活机体的体液免疫应答遥本研究发现袁免疫M hp活疫苗的猪群血清中无抗体产生袁在鼻拭子中能够检测到I gA的存在袁且经过PCR鉴定有M hp的存在袁随着时间的推移袁猪肺炎支原体含量逐渐降低遥这些结果与先前学者报道的一致[12]遥当前对于猪支原体肺炎抗体的检测并没有一个标准作为参照袁大多依据猪群的免疫渊下转P23冤. All Rights Reserved.情况尧临床症状以及剖检后肺部评分来确定猪群感染猪肺炎支原体的情况遥在当前猪病野老病不断袁旧病新发冶且多种疾病共感染的情况下袁根据上述依据已很难对M hp 疫苗的使用效果作出有效评定遥本研究通过M hp I gA 抗体检测方法的建立袁结合M hp 抗原检测以及市面上猪支原体肺炎血清抗体检测袁能够有效区分猪群M hp 自然感染或疫苗免疫的情况袁更有利于对猪群M hp 免疫情况进行评估袁为猪支原体肺炎疫苗的使用效果提供很好的评估方案遥参考文献院[1]Pi et er s M ,D ani el s J ,R ovi r a A.C om par i s on of s am pl e t ypesand di agnos t i c m et hods f or i n vi vo det ect i on of M ycopl as鄄m a hyopneum oni ae dur i ng ear l y s t ages of i nf ect i on [J ].V et M i cr obi ol ,2017,203:103-109.[2]杨汉春,王庆华,荣强.猪气喘病的免疫与防治技术[J ].中国兽医杂志,2003(12):37-39.[3]华利忠,冯志新,刘茂军,等.猪支原体肺炎疫苗的免疫原理及应用效果概述[J ].中国兽药杂志,2012,46(8):58-61.[4]M eyns T ,D ew ul f J ,K r ui f A ,et al .C om par i s on of t r ans m i s s i onof M ycopl as m a hyopneum oni ae i n vacci nat ed and non -vacci nat ed popul at i ons [J ].V acci ne,2006,24(49/50):7081-7086.[5]冯志新,刘茂军,熊祺琰,等.猪支原体肺炎活疫苗渊168株冤肺内免疫机制研究[J ].中国兽药杂志,2012,46(8):4-7.[6]曾常茜.分泌型I gA 在黏膜抗感染中的作用[J ].北华大学学报(自然科学版),2005,6(1):33-35.[7]王宁,谨瑾,刘璐,等.猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备尧表位鉴定及其初步应用[J ].畜牧兽医学报,2020,51(5):1110-1118.[8]Feng Z X ,B ai Y Y ,J i ng T ,et al .U s e of s er ol ogi cal and m u 鄄cos al i m m une r es pons es t o M ycopl as m a hyopneum oni ae ant i gens P97R 1,P46and P36i n t he di agnos i s of i nf ect i on [J ].V etJ ,2014,202(1):128-133.[9]逯晓敏,冯志新,刘茂军,等.抗猪肺炎支原体I gA 间接ELI SA 检测方法的建立[J ].畜牧兽医学报,2009,40(10):1569-1574.[10]刘茂军,邵国青,张映,等.猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R 1区的克隆与表达[J ].江苏农业学报,2005,21(3):207-211.[11]李春喜,姜丽娜,邵云,等.生物统计学[M ].北京:科学出版社,2016.[12]M i ni on F C ,A dam s C ,H s u T.R 1r egi on of P97m edi at esadher ence of M ycopl as m a hyopneum oni ae t o s w i ne ci l i a [J ].i nf ect i on and i m m uni t y,2000,68(5):3056-3060.[13]华利忠,白昀,武昱孜,等.猪支原体肺炎活疫苗渊168株冤气溶胶免疫后呼吸道SI gA 分泌及抗原留存规律[J ].中国动物传染病学报,2019,27(4):69-74.[14]刘茂军,靳岷,杜改梅,等.检测猪肺炎支原体抗体间接ELI SA 方法的建立[J ].江苏农业学报,2007,23(5):437-441渊上接P19冤3.3加大企业标准化资金投入加大标准化资金投入袁建立专项管理制度袁包含标准化人才的培养袁加大企业技术尧管理尧工作标准研制袁积极参与国家尧行业尧地方标准制修订遥同时袁也应加大对鸡舍尧饲养设施智能化的投资力度[4]袁不断增强自身在行业内的影响力和可持续发展能力遥3.4建立企业标准数据库平台通过构建规模化蛋鸡养殖场企业标准体系袁建立起一套完整的企业标准数据库袁方便各层级员工查看袁做到标准及时更新袁以达到提高各相关人员的工作效率尧提高各相关管理人员工作水平的目的遥3.5推进标准体系的实施和保持制定标准实施工作计划袁逐步实施标准体系内各项标准袁对实施过程中遇到的各类问题采取有效措施袁保证标准各项要求的贯彻落实遥做好标准实施的记录工作袁及时反馈各环节形成的数据和有关情况遥依据PD CA 管理模式[5-6]袁建立标准实施与监督检查制度袁对标准实施情况进行定期不定时监督和检查袁形成完整的实施检查记录和问题处理记录遥根据标准实施反馈信息袁及时调整和改进标准实施工作袁当发现标准中存在不完善的问题时袁及时对标准文本进行改进遥4小结企业标准体系的建立为规模化蛋鸡养殖场进一步完善企业管理提供了工作思路和理论依据袁为进一步提高蛋鸡养殖企业生产效率提供了技术支撑袁为鸡蛋产品质量安全和公共卫生安全提供了保障袁促进福建省蛋鸡养殖行业的健康快速发展遥参考文献院[1]贺朝铸.企业标准化建设中存在的主要问题及对策[J ].中国质量,2007(4):79-80.[2]国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.G B /T 35778-2017企业标准化工作指南[S].北京:中国标准出版社,2017.[3]刘阳利.蛋鸡生产生物安全管理体系的研究[D ].郑州:河南农业大学,2016.[4]蒋永健,吴捷刚,丁琳,等.浙江省蛋鸡产业现状调研及提升策略[J ].浙江畜牧兽医,2020,45(4):16-20.[5]易露.农业企业标准化研究[J ].价值工程,2019,38(33):79-80.[6]赵小丽.畜牧业标准体系建设现状及建议[J ].中国标准化,2019(13):157-160,175.. 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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用杨永能【摘要】猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触性呼吸道传染病,该病可给养猪业造成巨大的经济损失.为有效控制和确诊该病,根据报道的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒株的基因序列,合成了2对可扩增长度分别为442 bp和378 bp的特异引物,建立检测胸膜肺炎放线杆菌的巢式PCR方法.利用合成的引物在扩增猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌和大肠杆菌等细菌DNA时,结果均为阴性.用引物检测猪胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株可扩增出442 bp和378 bp的特异性条带.表明运用PCR法检测猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性和灵敏性均较高,可作为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段.【期刊名称】《中国猪业》【年(卷),期】2019(014)006【总页数】5页(P43-46,50)【关键词】猪传染性胸膜肺炎;放线杆菌;巢式PCR【作者】杨永能【作者单位】云南省楚雄彝族自治州动物疫病预防控制中心, 云南楚雄 675000【正文语种】中文【中图分类】S828;S852.61+9猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是世界范围的猪病，给养猪业带来了严重的经济损失。

为有效地预防和控制该病，建立一种快速、灵敏又特异的检测方法势在必行。

目前，国内诊断该病的方法大多是采用细菌分离鉴定和血清学诊断，细菌分离鉴定费时、费力、过程繁琐且有时分离不到致病菌；血清学诊断虽然简便、快速，但有其局限性，如亚临床感染或带菌状态下易造成假阴性，对免疫猪和感染猪不能做出有效的鉴别诊断。

猪传染性胸膜肺炎有15个血清型，目前，虽然已建立了以胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP） APXI、APXII、APXIII及OMP等某一DNA片段为目标基因的PCR诊断方法，但与胸膜肺炎放线杆菌相近的菌属较多，且也存在这些目标基因或者与目标基因差别极小的基因片段，在进行PCR扩增时，偶尔会出现假阳性，造成误诊。

猪支原体肺炎的诊断和防治体会猪支原体肺炎是由猪支原体引起的一种常见的细菌性呼吸道疾病，主要发生在生长期的猪群中。

这种疾病对猪的生长和免疫功能产生严重影响，给猪场生产带来了巨大的经济损失。

及时诊断和科学防治猪支原体肺炎对于猪场的生产和经济效益非常重要。

本文将从猪支原体肺炎的诊断和防治角度进行分析和探讨。

一、诊断1. 临床症状猪支原体肺炎的临床症状主要表现为咳嗽、打喷嚏、流清鼻涕、流泪、食欲减退、发热等。

肺部有时会出现呼吸困难的症状。

当发现猪群中出现上述症状时，应及时进行猪支原体肺炎的检测和诊断。

2. 病理学检查猪支原体肺炎的病理学检查主要是对死亡猪进行解剖，观察肺部组织的变化。

猪支原体肺炎的特点是肺部出现浆液性渗出和肺部纤维变性，并且肺脏呈现粉红色，而非正常的红色。

通过病理学检查可以初步判断猪是否感染了猪支原体肺炎。

3. 实验室检测目前，常用的实验室检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）和细菌培养。

ELISA可以检测猪支原体的抗体水平，PCR可以检测猪支原体的DNA，而细菌培养可以从猪的呼吸道分泌物中分离出猪支原体。

这些实验室检测方法可以准确地诊断猪支原体肺炎，为后续的防治工作提供重要依据。

二、防治1. 合理用药针对猪支原体肺炎，目前常用的治疗药物主要包括抗生素和疫苗。

抗生素可以对已经感染猪支原体的猪进行治疗，疫苗可以预防猪支原体肺炎的发生。

对于已经感染的猪，应该及时给予抗生素治疗，对于尚未感染的猪，则应该加强疫苗接种，提高猪的免疫能力。

2. 加强环境卫生管理猪支原体在环境中具有一定的稳定性，因此加强猪舍的清洁卫生管理是预防猪支原体肺炎的重要措施。

定期清洁猪舍，保持猪舍通风干燥，是预防猪支原体肺炎的有效途径之一。

对饮水系统和饲料进行定期消毒也是预防猪支原体肺炎的重要手段。

3. 控制环境压力猪支原体肺炎的发生与环境压力有一定的关系。

当猪场环境压力增大时，猪的免疫能力会下降，易感染各种疾病，包括猪支原体肺炎。

猪肺炎支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立车巧林;熊祺琰;冯志新;张旭;刘茂军;邵国青【摘要】This study was to establish an indirect immunofluorescence assay for detecting Mycoplasma hyopneumoniae adherence to host cells. Anti-Mycoplasma hyopneumoniae monoclonal antibody (McAb) was used as the primary antibody, and fluorescein isothiocyanate ( FITC) labeled goat anti-mouse IgG was used as the second antibody. The optimal working concentrations of antibodies were determined via optimizing consistence of the primary antibody and second antibody. The adhesion time was determined by the time needed for M. hyopneumoniae of 1 x 10 CCU/ml to adhere PK15 cells. The adhesion liter was determined through the adherence of M. hyopneumoniae with different liters to PK15 cells at 37 ℃ for 4 h. The optimum working concentrations of anti-M. hyopneumoniae McAb P463G11 and FITC-labeled goat anti-mouse IgG were 1 : 1 000 and 1:200, respectively. The time and titer of M. hyopneumoniae adhesion to the rnPK15 cells were above 4 b and 1×103 CCU/ral. The results indi cated indirect immunofluorescence assay could be used to detect M. hyopneumoniae adhesion to host cells.%为了建立一种用间接免疫荧光技术检测猪肺炎支原体黏附宿主细胞的方法.以抗猪肺炎支原体单克隆抗体为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG为二抗,通过对一抗、二抗工作浓度的优化确定合适的抗体浓度;通过以1×107 CCU/ml猪肺炎支原体与PK15细胞作用不同时间,确定其黏附细胞需要的时间;通过不同滴度的猪肺炎支原体与PK15细胞37℃作用4h,确定其黏附细胞需要的滴度.猪肺炎支原体单克隆抗体P463G11的最适工作浓度为1∶1000倍稀释,FITC-羊抗小鼠IgG的最适工作浓度为1∶200倍稀释,猪肺炎支原体黏附PK15细胞需要的时间为4h以上,黏附PK15细胞需要的滴度为1×105 CCU/ml以上.表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2012(028)005【总页数】5页(P1069-1073)【关键词】猪肺炎支原体;黏附;间接免疫荧光【作者】车巧林;熊祺琰;冯志新;张旭;刘茂军;邵国青【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S828.8+9猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎的主要病原。

猪肺炎支原体斑点杂交检测方法的建立及应用李桂兰;张映;邵国青【摘要】为建立猪肺炎支原体斑点杂交检测方法,并用于猪肺样品的检测,根据GenBank中登录的猪肺炎支原体(Mhp) P36基因序列,设计并合成一条地高辛标记的DNA寡核苷酸探针.进行Mhp斑点杂交反应,建立最佳反应体系和反应条件,对该方法进行特异性和敏感性试验,并采用最佳反应体系和反应条件在尼龙膜上对猪肺组织样品进行检测.结果表明,该检测方法可有效从可疑病料的猪肺组织中捡出Mhp感染,检出率为39.5％.本研究建立的Mhp斑点杂交检测方法快速、敏感、特异,对Mhp的临床检测具有较好的应用价值.%The aim of this paper was to establish dot blot hybridization method to detect Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), which would be used to detect the suspect swine lung samples. According to the sequence of Mhp P36 gene, a digoxin-labbled DNA probe was designed and synthesized. The optimum dot blot hybridization reaction system and conditions were established. The sensitivity and specificity tests were done, and then the lung samples of swine were detected by the established system and conditions on nylon membrane. The dot blot hybridization detection method of Mhp was established, the suspect swine infected with Mhp eouid be detected effectively by this method, and the detection rate was 39. 5%. The established Mhp dot blot hybridization detection method was rapid, sensitive and specific. Moreover, it would be helpful for clinical detection of Mhp.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(032)006【总页数】4页(P536-539)【关键词】猪肺炎支原体;斑点杂交;检测【作者】李桂兰;张映;邵国青【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S852.23猪支原体肺炎（Mycoplasma Pneumoniae of Swine，MPS，又名猪地方流行性肺炎和猪气喘病）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的慢性呼吸道病，主要症状为咳嗽和气喘，该病发病率高、死亡率低，主要引起猪的饲料转化率下降和生长受阻。

PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数
沈青春;覃青松;王琴
【期刊名称】《中国畜牧兽医文摘》
【年(卷),期】2006(000)005
【摘要】猪肺炎支原体(Mhp)是一种引起猪支原体肺炎(又称喘气病)的病原微生物,广泛流行于世界各地,在畜牧业发达的美国、澳大利亚等国也普遍存在,也是对我国养猪业造成严重经济损失的主要疾病之一。

其主要危害是引起猪的生长受阻、饲料转化率大幅下降,继发引起其他疾病的发生并加重发病症状,严重影响养猪的经济效益。

其感染率高,Wallgren等在对一个屠宰场的调查
【总页数】1页(P30-30)
【作者】沈青春;覃青松;王琴
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S85
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2.运用Real-time PCR方法研究日粮添加豆油与胡麻油对肉牛瘤胃纤维分解菌数量的影响 [J], 李旦;王加启;卜登攀;杨舒黎;魏宏阳;周凌云
3.PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数 [J], 沈青春;覃青松;王琴;宁宜宝;赵耘;宋立;张广川;吴惠明
4.规模化鸡场种蛋蛋壳、蛋内容物的总菌数、大肠杆菌数、沙门氏菌数测定 [J], 王红宁;马孟根;魏甬;柳萍
5.日粮同时添加酵母培养物与延胡索酸二钠对慢性酸中毒奶山羊瘤胃发酵和细菌数量的影响 [J], 王丽娟;刘大程;卢德勋;胡红莲
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