实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

— 为不凝集
(3) 红细胞凝集抑制试验 (HI 试验 )：新城疫病毒凝集红细胞的作用，能被特异性抗体抑制， 因此，可用 HI 试验 (简称血凝抑制试验 )测定鸡血清中的 HI 抗体效价 (滴度 ) ，并可用标准血 清，作新分离病毒的鉴定与未知病毒的诊断。
微量法：具体操作如下： ①用移液器向每孔加 0.05 毫升稀释液，十一孔加 0.1 毫升。 ②用移液器吸取被检血清 (或高免卵黄抗体 )0.05 毫升注入第一孔，抽放 6 次后，吸出 0.05 毫升，注入第二孔，如此连续稀释至第 10 孔，并从第十孔吸出 0.05 毫升弃去，血清稀释倍 数依次为 1： 2～ 1024， 11 孔和 12 孔空白。 ③ 每孔再加入已标定好的四单位病毒液 0.05 毫升，第十一孔为红细胞对照孔， 不加病毒液。
鸡新城疫病毒的 HA 试验与 HI 试验现采用微量法，以 u 或 v 形微孔塑料板代替试管。
① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴 (0.05 毫升 ) 。
② 用微量移液器取病毒抗原 0.05 毫升，加入第一孔，反复抽动 6 次后，吸出 0.05 毫升加入
第二孔，在第二孔反复抽动 6 次后，吸出 0.05 毫升加入第三孔，如此连续稀释至 第十一孔
水、 0.4mol/L 氢氧化钠液，二氯甲烷、酒石酸、苯、三氯醋酸、无水硫酸钠、弗罗里矽士、
丙硐、石油醚、蒸馏水、注射用水、精制敌百虫、 0.5%硫酸阿托品、氯磷定、解磷定、双复
磷、碘酊棉、酒精棉等。
4．实验步骤
一、诊断要点
（一）流行病学调查
（二）生前症状：主要为胆碱能神经受过量乙酰胆碱的作用所引起的过度兴奋现象。
后吸出 0.05 毫升弃去。第 12 孔不加病毒液为红细胞空白对照。
判断： 沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀， 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集； 如果孔
底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
如上例：病毒液的 HA 效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。
HI 试验时，病毒
能将 4 单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，
称为该血清的红
细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以
2 为底的对数 (log2) 表示。如上例，该血清
的红细胞凝集抑制效价为 1：64 或 HI 效价为 6(log2) 。第十一孔仅含稀释液和红细胞为不凝 集对照孔，第十二孔含稀释液，病毒液和红细胞为凝集对照孔。 结果分析如下：
胞保存液内 (保存液 2 份，血液 1 份 )于 4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经
3000 转／分钟，离心 5-10 分钟，用吸管
吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液
(生理盐水 )洗涤。再用离
心机 3000 转／分钟离心 5-10 分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后
① 一般认为鸡的免疫临界水平为 1： 8(成年 ) 或 1： 16(雏鸡 )，但随地区不同而有差异。
② 鸡血清的 HI 抗体效价高于 1： 16 时可适当推迟新城疫免疫的时间， HI 抗体效价在 1：
16 以下，须马上进行新城疫疫苗接种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平， 应再提高。
③ 鸡群的 HI 抗体水平是以抽检样品的 HI 抗体效价 (1og2) 的平均值表示的。
理盐水溶液。必要时重复使用。
1. 阿托品（ Atropinum ）抗胆碱药。
2. 氯磷定（ Pyraloximi Methy Chloriaum ，PAM-CL或 2-PAMCL）为胆碱酯酶复活剂。
3. 解磷定（ Pyraloximi Methiodidum ， PAM）胆碱酯酶复活剂。
4. 双复磷（ Toxogoninum ，DMO-4 ）亦为胆碱酯酶复活剂。
胞凝集抑制试验 (HI) 。
3．需用的仪器或试剂等
动物 健康成鸡 2-5 只，被检鸡 15-25 只。
器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径
来自百度文库
2mm 聚乙
烯塑料管 100cm、酒精灯、石蜡、 96 孔 V 型微量凝集试验板、 0.025mm 微量吸液器、微型
振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
2.氯磷定（ Pyraloximi Methyl-Chloriaum ， PAM-CL 或 2-PAMCL ）为胆碱酯酶复活剂。 原理：能与磷酰化胆碱酯酶中的有机磷结合，使胆碱酯酶释放并恢复其水解乙酰胆碱 的活性；还能直接与有机磷结合为无毒物质排出体外。
3．需用的仪器或试剂等
动物：有机磷中毒病例，或用试验动物（猪或兔）做人工病例复制。
④ 置振荡器上振荡 1-2 分钟，放 18～ 22℃静置 20 分钟。 ⑤ 每孔再加入 0.7％红细胞悬浮液 0.05 毫升，放振荡器上振荡 l-2 分钟，置 18-22℃， 30-60 分后判定结果。 ⑥ 第十一孔为红细胞对照孔，第十二孔作为抗原对照孔。
HI 试验与结果
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
实验二 兔有机磷中毒的诊断和治疗
1、 本次实验的目的和要求 掌握有机磷中毒的诊断要点 熟悉有机磷中毒的简易检验方法。 了解有机磷中毒的解毒原理和治疗措施。
2．实验内容或原理 1.阿托品（ Atropinum ）抗胆碱药 原理：通过阻止乙酰胆碱和受体的结合而产生抗胆碱作用。但有机磷中毒病畜对阿托
品的耐受性较高，故需用常规剂量的 2（牛）～ 4（羊）倍。
鸡新城疫血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）抗体水平测定法
1．本次实验的目的和要求
掌握鸡新城疫血凝（ HA ）和血凝抑制（ HI ）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果
和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理
某些病毒 (如新城疫病毒，禽流感病毒等 ) 能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞 凝集现象 (HA) 。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细
25
25
25
25
25
抗原 (病毒 ) 25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
红细胞悬液 25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
25
作用时间与温度
轻轻振荡 1-2min
静置 30-60min
结 果 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ﹣
﹣﹣
﹣
﹣
注意： +++ 为完全凝集 ++为部分凝集
25
25 弃去
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
50
25
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25 弃去
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
作用时间
振荡 1-2min ，静置 20 min
与温度
红细胞悬液
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
药剂（ 1）浓缩抗原； （ 2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（ PBS ）；（ 3）Alsever 细胞保存液；
（4）红细胞悬液； （5）待检血清
4．实验步骤
(1) 发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被 特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如 抗体效价有 4 倍以上升高，即有诊断意义。
器材：测瞳尺、磁反应板、磁蒸发皿、乳钵、分液漏斗、分液漏斗架、离心机、培养
皿、玻璃容器、量筒、棕色玻璃、玻棒、微量吸管、
25ml 滴管、注射器、针头、听诊器、
体温计、定性滤纸、新华滤纸、试纸、纱布、脱脂棉、剪刀、解剖器械、载玻片、皮筯等。
药物试剂：氯仿、氯化乙酰胆碱、溴麝香草酚蓝、无水乙醇、干燥马血消化、饱和溴
2．实验内容或原理 根据典型症状和病变，以及在显微镜下检查组织涂片发现的两极染色的杆菌，可初步
诊断本病。但确诊应依靠病原分离鉴定，病原分离鉴定原理为革兰氏染色法。 3．需用的仪器或试剂等
动物：鸡、小白鼠 器材：外科镊子、外科剪、灭菌纱布、载玻片、糖发酵管等。 药品： 草酸铵结晶紫、 革兰氏碘、 碳酸复红、 瑞特氏染液、 美蓝染液、 棉拭子、 接种环、 葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、绵子糖、菊糖、赤藓 糖、戊五醇、 M —肌醇、水杨苷。胰蛋白酶、 L- 胱胺酸、琼脂粉、酚红。
5．教学方式
讲述与实验
6．考核要求
实验报告
7．实验报告要求
1. 有机磷中毒的诊断要点有哪些？ 2. 治疗在机磷中毒的最好方案是什么？其理论基础何在？
实习三 禽霍乱 (禽巴氏杆菌病 )诊断技术（综合性）
（三个实验计 9 学时）
1．本次实验的目的和要求 （ 1）观察家禽巴氏杆菌病的临诊表现和病理解剖变化 （ 2）掌握禽巴氏杆菌病的微生物学诊断方法
如果某鸡群的 10 份样品中， HI 抗体效价为 8 的有 3 份样品，为 7 的有 5 份样品，为 6 的有 2 份样品，它们的平均值为：
平均水平在 4(log2) ，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中 HI 抗体效价的最高值与最低 值相差太大时， 则不能用上法计算平均水平， 应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所 占的百分比决定免疫与否。 ④ 大型养鸡场， 每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1％～ 0.5％，小型鸡群，抽样率应有 所增加，一般认为理想的抽样率应为 2％。 ⑤ 鸡群接种新城疫疫苗后，经 2～ 3 周 测血清中的 HI 抗体效价，若提高 2 个滴度以上，表 示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若 HI 抗体效价无明显提高，表示免疫失败。 附注： ①采用 HA 试验对各生物药厂生产的新城疫疫苗产品有质量检测作用。 ②采用 HI 试验对各厂家生产高免血清及卵黄抗体有质量检测作用。
（3）免疫机体抗体效价的测定：
3.鸡新城疫（ ND ）的 HA 和 HI （1）试验准备
① 抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或 LaUra 系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管
(按每毫升血加
入 3.8％灭菌柠檬酸钠 0.2 毫升做抗凝剂 )内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细
11
12
被检血清 稀释倍数
稀释液 被检血清
稀释液 标准阳性血清
4 单位病毒
红细胞 抗原 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 对照 对照
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
50
25
25 25 25
25 25 25 25
25
出现以下三类症候群。
1. 草蕈碱样症状
2. 烟碱样症状
3. 中枢神经症状
（三）有机磷检验
1. 检品的采取和处理
2. 有机磷检验法
（ 1）酶化磷检验法
（ 2） B.T.B 全血试纸片法
（四）病理变化
二、治疗措施
具体方法为：①静脉注射阿托品 1/3 量的 2%溶液以迅速取得效果；②皮下注射阿托品
2/3 量的生理盐水溶液以取得持续效果； ③分点皮下注射氯磷定或其他胆碱酯酶复活剂的生
一次离心后的红细胞泥， 按 0.7％的稀释度加入稀释液 (0.7 毫升红细胞泥加 99.3 毫升稀释液 )。
③ 被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内
(微
量法可用孔径 2-3 毫米塑料管由翅静脉采血 )，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。
每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。
25
作用时间 与温度 结果 1
振荡 1-2min ，静置 30-60 min — — — — — — ++
+++ +++ +++
— +++
结果 2
— —— —— — —
—
— ++ +
— +++
结果观察： 将反应板倾斜成 45℃角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾 斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
抗原液为 0.05 毫升内须含 4 个凝集单位，则应将原病毒液作成 64／4=16 倍的稀释液。
孔号： 滴度：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:517 1:1024 1:2048 对照
稀释液
25 25 25
25 25 25 25
④ 稀释液：为灭菌的生理盐水。
⑤ 红细胞保存液的配制方法：葡萄糖 2.05 克，柠檬酸钠 (SHOO)0.80 克，柠檬酸 (2H 20)0.055 克，氯化钠 0.42 克，蒸馏水加至 100 毫升。过滤分装，高压灭菌 10 分钟，放 4℃冰箱保存。
(2) 红细胞凝集试验 (HA) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所 用病毒稀释倍数 (抗原单位 )。