实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验作业指导书1、血凝试验1.1 材料与试剂1.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V 形血凝反应板。

1.1.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS)配制方法参见附录A。

1.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。

1.1.4标准新城疫病毒抗原、购入的标准新城疫病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。

若不符，应重复检测并到相关实验室验证。

2、血凝试验操作程序2.1 血凝试验操作程序如下：2.1.1 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔-12孔每孔加0.025mLPBS；2.1.2 吸取0.25mL病毒悬液加入第1孔中，吹打3次-5次充分混匀；2.1.3 从第1孔中吸取0..25mL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0.025mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取0..25mL弃之，设第12孔为PBS对照；2.1.4 每孔再加入0.25mLPBS。

2.1.5 每孔均加入0.25mL体积分数为1%鸡红细胞悬液；2.1.6 振荡混匀反应混合液，室温20℃-25℃下静置40min 后观察结果，若环境温度太高，放4℃静置60min,PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。

2.2 结果判定2.2.1 在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝聚。

以完全血凝的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。

完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1一个血凝单位（HAU）。

2.2.2 如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离尿囊液继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。

2.2.3 对于血凝试验呈阳性的样品应采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。

3、血凝抑制试验3.1 材料与试剂3.1.1 器材同1.1.1.3.1.2 试剂同1.1.2.3.1.3 标准抗NDV血凝抑制抗体（血清）。

新城疫抗体测定（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照（20分）；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1-2-12（25分）。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀（25分）。

4、室温静置10-30分，观察结果（10分）。

5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。

结果判定：以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度（20分）。

注意:由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞上解脱下来，所以要及时观察结果。

（二）血凝抑制试验（HI）：取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价乘4即为4个单位血凝素的稀释度（10分）。

2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔…,依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为2-1-2-12（20分）。

3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀（20分）；4、室温静置20min（5分）；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀（15分）。

6、室温静置10--30分，观察结果（10分）；结果判定：以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制（HI）滴度（20分）。

鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。

鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。

鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验（一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。

(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。

血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。

（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。

（四）实验步骤：一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。

4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。

5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI 效价，用2n表示。

二、血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。

2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。

3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。

3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。

如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。

再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。

鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象()。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验()。

3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2聚乙烯塑料管100、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（）；（3）细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（）的和（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。

如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。

再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。