血清双向电泳研究中的失误分析及解决

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种在两个方向上进行电泳分离的技术，通常用于核酸和蛋白质的分析。

在进行这种电泳过程中，可能会遇到一些问题。

以下是一些常见问题及其可能的解决方法：
1.电泳带模糊或不清晰：
-可能原因：
-样品质量不纯。

-缓冲液配制有问题。

-电场均匀性差。

-解决方法：
-使用纯净的、高质量的核酸或蛋白质样品。

-重新配置新鲜的缓冲液。

-检查电场均匀性，确保电场平均分布。

2.电泳速度过快或过慢：
-可能原因：
-电流设置不当。

-缓冲液浓度不正确。

-解决方法：
-调整电流，确保在设备规定的范围内。

-检查并重新配置适当浓度的缓冲液。

3.电泳带变形或扭曲：
-可能原因：
-样品加载不均匀。

-凝胶浓度选择不当。

-解决方法：
-确保样品加载均匀，使用适当的体积和加载方法。

-重新制备适当浓度的凝胶。

4.电泳凝胶干燥或开裂：
-可能原因：
-凝胶聚合物浓度太高。

-电泳室湿度不足。

-解决方法：
-降低凝胶聚合物的浓度。

-提高电泳室的湿度，可以考虑使用湿度控制设备。

5.样品负载量过多或过少：
-可能原因：
-样品量测量错误。

-样品浓度过低。

-解决方法：
-确保准确测量样品量。

-调整样品的浓度，确保在电泳中可以产生明显的带。

在实验过程中，及时记录实验条件和参数，有助于更容易地识别和解决问题。

如果问题持续存在，建议向实验室同事、导师或相关领域的专家寻求帮助。

蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析Ξ刘健平,陈国华,陈本美,周　平,唐瑶云(中南大学湘雅医学院分析测试中心,中国湖南长沙　410078)摘　要:从以固相pH梯度等电聚焦为第一向,S DS2PAGE电泳为第二向进行的蛋白质组双向电泳实验中挑选了一些常见的硝酸银染色22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.关键词:固相pH梯度;蛋白质组;双向电泳中图分类号:Q5233 文献标识码:A文章编号:100727847(2003)022******* Analysis of T roubles in22Dimensional G elsE lectrophoresis of Proteomic StudiesLIU Jian2ping,CHEN G uo2hua,CHEN Ben2mei,ZHOU Ping,T ANG Y ao2yun (The Central Testing Lab,Xiangya School o f Medicine,Central South Univer sity,Changsha410078,Hunan,China)Abstract:S ome failure images in22dimensional gel electrophoresis of proteomic studies were collected and classified.P ossible reas ons for troubles were analyzed and the methods to overcome them were discussed.K ey w ords:imm obilized pH gradient;proteome;tw o2dimensional gel electrophoresis(Life Science Research,2003,7(2):177～180) 蛋白质组学是新近形成的生命科学研究热点,一般包括双向电泳分离技术和质谱检测鉴定技术两大部分.双向电泳分离技术所涉及的环节较多,一般包括蛋白质提取、等电聚焦、蛋白质转移、S DS2PAGE电泳、凝胶硝酸银染色等环节,每一环节又包括若干步骤,如蛋白质提取环节又可以细分为裂解液组成配方、裂解方式选择、抑制蛋白酶降解活性、使蛋白质溶解、去折叠、变性及解聚合、除去核酸、离子、脂类、多糖类、酚类等杂质步骤.由此可见双向电泳分离技术是一个受多种因素控制的技术,其中任何一种因素没有理想地控制好都有可能引起整个实验的失败,而且这种失败往往要等到双向电泳图谱硝酸银染色显影之后才能看到,此时不但已耗费大量人工和试剂,而且有时还难以迅速和准确地找到失误的真正原因.我们从实际工作中挑选了一些典型的22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.1　取图方法根据蛋白质斑点的有或无、斑点是否规则清晰、斑点是否有横向或纵向条纹、斑点在整张图谱中的分布是否扭曲或倾斜或团聚或离散、凝胶的背景色是否清晰均匀、凝胶图谱中非斑点处是否有横向或纵向的条纹及条纹出现的位置等标准,从大量22DE凝胶硝酸银染色结果图谱中挑选出一些典型的失误图谱作为分析研究的对象.第7卷　第2期2003年6月 生命科学研究Life Science Research V ol.7　N o.2June2003Ξ收稿日期:2002212229;修回日期:2003202225作者简介:刘健平(19712),男,湖南溆浦人,中南大学助理研究员,硕士,主要从事蛋白质组学和蛋白质化学研究,T el:+86207312 4805312,E2mail:hnljp888@2　失误图谱图1～10中,从左到右为第一向等电聚焦阳性到阴性的方向,从上到下为第二向S DS2PAGE 电泳高分子量蛋白质到低分子量蛋白质的方向.图1　仅图谱下端能看到少量斑点Fig.1　Only little spots are visible in low p art of thegel图2　部分斑点在垂直方向向某条纵轴倾斜Fig.2　Spots concentrate to a vertical axis line ofgel图3　部分斑点在局部区域团聚Fig.3　Some spots aggregate and crowd in thegel图4　图谱上端非斑点处有较多垂直方向条纹或团块Fig.4　V ertical streakΠsmear or agglomerate in thegel图5　有黑色颗粒和手印等杂质,看不到斑点Fig.5　Spots are invisible,contaminated by black p ar2ticles andfingerprint图6　图谱上端非斑点处有水平方向的浓条纹Fig.6　H orizontal stripes across the whole up p art of gel 871 生　命　科　学　研　究 2003年图7　在垂直方向单个斑点变成双点Fig.7　Spots verticallydoubled图8　斑点在水平方向有拖迹条纹Fig.8　Spots streakhorizontally图9　图谱在非斑点处有垂直方向的“∧”型纹、空白间隙或斑点不规则扭曲Fig.9　V ertical “∧”streak or gap or spots distortion across the wholegel图10　部分斑点有垂直方向拖迹条纹,背景色很深Fig.10　Some spots streak vertically and high b ack 2ground3　原因分析及讨论对于图1,可能的原因及解决办法:1)蛋白质从第一向转移到第二向时不完全,应该在第二向电泳开始时按单片凝胶10mA 先跑30min 的低电流电泳,然后再升高到单片凝胶20mA 电泳至溴酚蓝迁移到底部为止;2)平衡时间不充分,蛋白质被重新氧化,应该延长胶条的平衡时间至15min ,平衡液需要新鲜配制;3)蛋白质在水化时没有充分进入胶条,应该新鲜配制并且添加足够体积的水化液进入第一向电泳槽中,如在18cm 规格的第一向电泳槽中应该添加350μl 的水化液,另外还可提高IPG 缓冲液的浓度,如由0.5%提高到2%及延长等电聚焦的时间;4)蛋白质在高重力场下(>105g )长时间离心会使高分子量的蛋白质非特异性地丢失,应该避免对样品的这种离心处理.对于图2,可能的原因及解决办法:1)凝胶聚合太快或聚合时发生泄露引起左下角局部区域不均匀,应该将凝胶混合均匀再灌胶并且检查是否泄漏后再封一层薄水层;2)第二向凝胶顶端不平整引起胶条与它接触不好,使得琼脂糖固定液渗入两者之间的接触面空隙,或气泡或杂质渗入,应该平整好第二向凝胶顶端,放置胶条时要排除气泡或杂质.971第2期 刘健平等:蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析 对于图3,可能的原因及解决办法:1)凝胶浓度不合适,或聚合不均匀,应该调整分离胶的浓度并正确灌制凝胶;2)电泳时电流过大,电泳过程太快,应该降低电泳的电流至单片凝胶20mA;3)琼脂糖固定液浓度过高,或杂质阻止高分子蛋白质顺利进入第二向凝胶,应该使用新鲜配制0.5%的琼脂糖固定液,或除去杂质.对于图4,可能的原因的解决办法:1)蛋白质样品中含有较多的核酸,它们增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹,甚至还可能封闭凝胶孔,应该使用DNase I和RNAase A酶降解它们;2)核苷酸、磷脂、代谢物等内源性的小离子杂质常常造成胶条阳性端等电聚焦不理想,应该用TC AΠ丙酮法、透析等方法除去它们;3)两性电解质被银染上色,应该使用IPG缓冲液作为两性电解质,必要时可将其浓度降低至0.5%.对于图5,可能的原因及解决办法:1)银染步骤中硝酸银试剂失效,应该使用新鲜配制的硝酸银溶液染色,要戴干净的塑料手套并使用新鲜过滤的双蒸水;2)敏化、显影等步骤中的试剂含较多杂质,应该使用高纯度的试剂.对于图6,可能的原因及解决办法:1)第二向电泳缓冲液中含有杂质,或电泳装置不干净,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使用干净的玻璃板和电泳槽电泳;2)琼脂糖固定液含有杂质,应该使用新鲜配制的琼脂糖固定液.对于图7,可能的原因及解决办法:1)胶条在第二向凝胶顶端没有正确放置,应该以胶条的塑料保护膜面紧贴长玻璃板的方式放置胶条入两玻璃板的空隙内;2)水化液体积不够,或水化液在等电聚焦槽内分布不均匀使得胶条或胶条的局部区域水化不充分,应该确保足够的体积的水化液在整个第一向等电聚焦槽内均匀铺开,排除胶条胶面与槽面之间的气泡.对于图8,可能的原因及解决办法:1)等电聚焦不充分,应该延长等电聚焦的时间,可以使用3 500V或8000V的高电压以便取得良好的等电聚焦效果;2)过度等电聚焦(>105Vh)能够造成电渗和蛋白质飘移,应该减少等电聚焦的时间;3)蛋白质样品中含有离子,或离子型去污剂如S DS,应该将水化液的离子浓度控制在10mm olΠL以内,可以采用透析、层析、TC A沉淀等方法脱去离子,或使非离子型去污剂的浓度至少8倍于S DS的浓度;4)离子等杂质影响等电聚焦,尤其在酸性端如此,应该除去样品中的杂质.对于图9,可能的原因及解决办法:1)对水平S DS2PAGE而言,凝胶上面的水滴,或下面的气泡会引起热传导不均匀,应该使凝胶稍干燥或排除气泡后再电泳;2)气泡或水化液中的杂质存在于胶条与第二向凝胶顶端的接触面之间,应该排除气泡或杂质;3)电泳时热传导不均匀,或温度过高,应该调节电泳时恒温水循环仪温度为16℃;4)蛋白质没有充分溶解,应该增加裂解液中尿素或CH APS等试剂的含量使蛋白质尽可能完全地、稳定地溶解.对于图10,可能的原因及解决办法:1)硝酸银染色中显色时间太长导致凝胶背景底色过深,应该减少银染和显色时间;2)第二向电泳缓冲液配制不当,S DS含量不足,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使S DS含量达到0.1%;3)对水平S DS2PAGE而言发生了电渗现象,应该在平衡液中添加甘油和尿素.蛋白质组双向电泳分离技术是受多种因素影响的多步骤实验,只有处理好样品的裂解、蛋白质的提取、溶解和变性、杂质的去除、胶条的水化、蛋白质的等电聚焦、胶条的平衡、S DS2PAGE、凝胶的硝酸银染色显影等步骤,才有可能获得较高重现性、可比性和稳定性的22DE图谱,蛋白质组双向电泳分离技术的实验条件才算成功建立.参考文献(R eferences):[1]　BERKE LM AN T om,STE NTE DT T irra.22D E lectrophoresis UsingImm obilized pH G radients Principles&M ethods[M].US A:Amersham Pharmacia Biotech,1998.37241.[2]　ESTE VE2ROMERO J,SIM O2A LFONS O E,BERSCIANI F.Sam plestreaks and smears in imm obilized pH gradient gels[J].E lectrophoresis,1996,17:7042708.081 生　命　科　学　研　究 2003年。

探讨检验科血液标本检测中的常见误差原因及预防措施血液标本检测是临床检验中非常重要的一环，它可以帮助医生诊断疾病、监测疾病的进展以及评估治疗效果。

在这一过程中，常常会出现各种误差，这些误差可能会影响到诊断结果的准确性和可靠性。

了解血液标本检测中的常见误差原因及预防措施对于提高检验质量非常重要。

一、常见误差原因1. 人为操作失误：在采集、储存、运送、处理和分析血液标本的各个环节，都可能受到操作员的不规范操作而引起误差。

在采血时未正确定位静脉、使用不干净的采血器具、采血后混入异物等，都会对检测结果产生影响。

2. 样本不合格：由于各种原因，包括采样过程中的错误、血样的不合适储存和运输，以及标本的污染等，会导致血液标本不合格，无法得到准确的检测结果。

3. 仪器故障：仪器本身的故障或不良品，也会导致检测结果的误差。

温度、湿度和磁场等环境条件对于某些仪器的精度会有很大的影响。

4. 试剂质量：试剂的质量问题也是造成误差的一个重要原因。

试剂若沉淀、过期或被污染，都会导致检测结果的不准确。

5. 数据处理：数据的处理过程中，由于操作员的疏忽或者不正确操作，也可能引起误差。

输入的信息错误、转录错误或者计算错误等都会影响数据的准确性。

二、预防措施1. 严格规范操作流程：在采集、处理和分析血液标本的全过程中，必须严格遵守操作规程，确保操作的规范性和准确性。

对于每一个环节，都要有相应的操作规程，并严格执行，消除人为操作失误的可能。

2. 定期维护设备仪器：对于所有使用的设备仪器，必须定期进行维护和检验，确保它们的正常运转。

还需要培训操作员正确使用设备仪器，并对设备仪器进行定期的校准和验证。

3. 样本质量控制：在采样、储存和运输过程中，必须严格控制样本的质量。

采样时必须使用清洁无菌的工具，样本必须在规定时间内进行分析等，确保样本的质量满足检测要求。

4. 试剂的质量控制：对于使用的试剂，也必须进行严格的质量控制。

采用品质可靠的试剂，并进行正确的保存和使用，严禁使用过期试剂和污染试剂，确保试剂的质量。

血清醋酸纤维薄膜电泳实验常见的问题分析电泳是带电颗粒在电场的作用下，向着与带电颗粒电性相反的电极迁移的现象。

电泳法可用于分离、鉴定或提纯许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等，因此电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究工作的一种常规的不可缺少的工具。

电泳法(血清醋酸纤维薄膜电泳分离及测定)作为一项基本方法，已成为医学生生物化学实验教学常规开设的实验内容，该法操作简便，快速、价廉，样品用量少，实验技术成熟，分辨能力强，没有吸附现象、效果直观，便于保存等优点，但影响电泳图谱的因素较多，学生在实验中操作不当等，均可导致实验失败而得不到理想的电泳图谱。

因此，为了达到预期的实验效果、提高学生对电泳实验的动手能力，根据我校学生血清醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis，CAME）实验的实际情况，本文对CAME实验中电泳图谱常见的问题进行分析，以期为CAME实验教学提供参考。

1.出现五条以上的区带在CAME实验中，有的同学电泳实验结果看起来很“完美”，有“许多”区带——五条以上（实验结果应是五条区带，分别是清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白），为什么会有这种现象呢？原来出现的“许多”区带（五条以上）正是在点样中出现的，有的同学在点样过程中实施“二次”点样［１］。

CAME实验包含准备、点样、平衡、电泳、染色、漂洗、定量（该步骤没要求）等步骤，其中点样成功是获得清晰电泳图谱的关键。

在试验中，为了便于学生操作，我们应用玻片进行点样，有的同学没有擦干玻片两侧的血清；有的同学觉得点样量太少，又重复进行一次点样。

没擦干玻片两侧的血清，导致玻片两侧有两个点样面，后者进行的“二次”点样不可能在同一个位置，在进行电泳时，有的区带“跑”得快，有的“跑”得慢，区带与区带之间有的重叠，有的未重叠，因而分离出五条以上的区带（事实上，在某一区带并不是同一种蛋白质）；有的同学进行多次（两次以上）点样所得到的电泳图谱成片。

用户园地26双向电泳常见问题回答(一)——样品制备试剂盒篇双向电泳，作为蛋白质组学研究的经典手段，已经得到非常广泛的应用。

然而双向电泳不是一件简单的差事，太多的不确定性困挠大家，我们近期将推出系列双向电泳常见问题回答，内容涵盖样品制备，一向等电聚焦，到二向SDS电泳等，希望能给大家的实验提供参考。

众所周知，要得到良好的双向电泳结果，其技术的核心就是样品制备，这一步处理的好坏将直接影响2-D 结果。

在最初的样品制备中丢失的关键蛋白永远不能失而复得，GE Healthcare Ettan系列的样品制备试剂盒为双向电泳的样品制备提供了方便、可重复的、一致的解决方案。

以下我们总结分析了大家在使用样品制备试剂盒时常见的问题及可能原因，便于参考。

Sample Grinding kit 样品研磨试剂盒应用：样品研磨试剂盒是即用型裂解少量组织和细胞样品以提取蛋白的试剂盒Q：树脂干了，是否还能再用？A：可以，树脂是惰性的材料，没有影响Q：是否研磨树脂会破坏高分子的蛋白或DNA？是否会结合蛋白和核酸吗？A：不同于其他的研磨材料，我们的研磨树脂很不会破坏gDNA或高分子量的蛋白，也不会结合蛋白和核酸。

2-D Protein Extraction Buffer蛋白抽提缓冲液应用： 2-D蛋白抽提缓冲液为制备高质量的蛋白裂解液提供了一种便利的方法。

目前有6种蛋白抽提缓冲液可供选择，便于用户筛选最合适的缓冲液。

这6种蛋白抽提缓冲液皆源自对可靠而有效的蛋白抽提缓冲液的升级改良，以求进一步提高2D凝胶分析中的点分辨率。

Q：一个包装的抽提缓冲液可以用来处理多少样品？A：对于Trial Kit，处理10-20个样品（100mg组织），常规包装的缓冲液可以处理50-100个样品。

Vivaspin sample concentratorsVivaspin超滤浓缩管应用：Vivaspin Sample Concentrators适用于以膜超滤的方式对生物样品进行快速非变性的浓缩。

血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化张明顺; 李雪华; 兰晓霞; 栾大伟; 赵化冰; 王世鑫【期刊名称】《《医学信息》》【年(卷),期】2010(023)007【摘要】目的建立稳定的人血清蛋白质组双向凝胶电泳（2-DE）技术体系,提高人血清蛋白2-DE图谱的分辨率和重复性。

方法采用固相pH梯度（IPG）等电聚焦（IEF）为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条选择、等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳程序及参数等进行了比较和优化。

结果两样品经过3次重复,还原烷基化蛋白质斑点数（678±32）个,非还原烷基化蛋白质斑点数（358±26）个,还原烷基化分离较好,电泳图谱更清晰。

结论还原烷基化处理能提高血清蛋白质2-DE的分辨率,该方法也可对其它蛋白质样品的制备和双向电泳提供借鉴作用。

【总页数】3页(P2310-2312)【作者】张明顺; 李雪华; 兰晓霞; 栾大伟; 赵化冰; 王世鑫【作者单位】天津武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室天津300162【正文语种】中文【相关文献】1.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 董红;王世鑫;罗来龙;栾大伟2.寻常型银屑病血清蛋白质组学研究中双向凝胶电泳-质谱技术的初步建立 [J], 刘占奎;谭升顺;于春水;樊靖华;白转丽;李俊杰3.优化并建立双向凝胶电泳初步研究糖尿病视网膜病变血清蛋白质组 [J], 李俊;贾丽丽;陆琳娜;王悦4.家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立 [J], 要瑞莉;张明顺;李宏杰;董淑云;王世鑫;冯桂玲5.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 张明顺;李雪华;兰晓霞;栾大伟;赵化冰;王世鑫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。