液相色谱仪检定中常见的影响因素及解决方法

液相色谱仪检定中常见的影响因素及解决方法1.气泡
由于HPLC系统中气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。

造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。

为了避免这类问题的出现，HPLC实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理；在HPLC系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净；在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。

2.柱温
在操作HPLC时，色谱柱是在室温环境下工作的。

大多数的工作环境温度是不断变化的，温度的差别就会引起较复杂的问题。

温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脱方式受温度的影响。

等度洗脱时温度会影响保留时间，当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高１℃，保留时间会缩短(1~3)％。

温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。

温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响。

即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般也会有较大的变化。

温度变化还可能引起选择性显著变化。

正如柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问题在峰宽上的影响尤其明显。

当温度变化
时除了选择性和保留时间的变化之外，峰宽也会发生变化。

升高温度通常会使理论塔板数升高，峰宽变窄，由于峰面积不变，峰越窄就会越高，因此升高温度可以达到更小的检测限。

柱子里的温度变化也会影响峰形。

当流动相和柱子之间的温差增大时，由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。

为了获得一致的结果我们必须要控制柱温，使用柱温箱是最好的办法。

如果没有柱温箱，最有效的办法就是将色谱柱隔绝在一个温度波动最小的地方。

3. 色谱柱污染
色谱柱污染会引起保留时间漂移。

HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。

污染源可能是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。

样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能使保留时间漂移。

通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。

可以通过使用固相提取等样品前处理方法来去除样品基质的影响。

避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。

相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。

通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。

使用保护柱是个非常有效的方法。

反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。

4.色谱柱平衡
如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。

通常平衡需要10~20个柱体积的流动相。

但如果在流动相中加入
少量添加剂则需要相当长的时间来平衡色谱柱。

需要柱子的充分平衡，然后才能对HPLC进行检定。

5.流动相有机溶剂
HPLC分析总要求使用HPLC纯的试剂，关键是两点：纯度高、紫外吸收小。

纯度高，是希望没有杂质干扰HPLC分析；不会有金属离子损害纯度为99.99%以上的高纯度硅胶基质。

可以通过重蒸分析纯溶剂；或滤膜过滤，并定期把前置的过滤头取下，放稀硝酸里清洗，再用纯水洗至中性。

流动相有机溶剂可能影响HPLC的检测限。

6.柱压
柱压过高是HPLC分析中常碰到的问题。

其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题。

溶剂或样品含有颗粒杂质，这些杂质将筛板堵塞引起压力上升，应更换柱子入口筛板；泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；比例阀失效，应更换比例阀；泵密封垫损坏，应更换密封垫；系统检漏，则找出漏点，密封即可。

HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰形应对称而尖锐。

充分考虑到可能影响分析结果的因素，可以科学地进行液相色谱仪的检定。