肺癌患者外周血中Th22细胞及效应因子IL-22的表达和临床意义

肺癌患者外周血中Th22细胞及效应因子IL-22的表达和临床意义
作者：马雪梅王晶马雷
来源：《中国现代医生》2020年第13期
[摘要] 目的探討Th22细胞及效应因子IL-22在肺癌患者外周血中的表达程度，并探讨其与肺癌淋巴结转移及肿瘤大小、病理类型的相关性。

方法选取2018年11月～2019年5月在我院住院确诊的肺癌患者40例为实验组;对照组为随机选取来自于同一时期门诊体检的40例健康人群;用流式细胞术检测外周血中Th22细胞（CD4+IL-22+）的比例，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中IL-22浓度变化;对比观察两组Th22细胞及IL-22因子的表达变化。

结果在肺癌患者中，Th22细胞、IL-22因子的表达均高于对照组（P<0.01），从相关性分析图看出二者呈正相关（r=0.631，P<0.01）;且实验组患者有淋巴结转移者与无淋巴结转移者比较，Th22细胞、IL-22因子数值增大，差异有显著性（P<0.05）;实验组随着肿瘤直径逐渐增大，病理类型不同，Th22细胞、IL-22因子数值增加，差异有统计学意义（P<0.01）。

结论肺癌患者外周血中Th22、IL-22表达频率明显升高，与肺癌病理类型、淋巴结转移、肿瘤大小密切相关，有望为肺癌的研究增添新的思路。

[关键词] 肺癌;Th22细胞;IL-22因子;流式细胞术
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2020）13-0011-04
[Abstract] Objective To explore the expression level of Th22 cells and effector IL-22 in peripheral blood of patients with lung cancer， and to explore its correlation with lymph node metastasis， tumor size and pathological type of lung cancer. Methods Forty patients with lung cancer diagnosed in our hospital from November 2018 to May 2019 were collected as the experimental group. The 40 healthy people who underwent outpatient physical examination at the same period were set as the control group. The proportion of Th22 cells （CD4+ IL-22+） in peripheral blood was detected by flow cytometry. The change of serum IL-22 concentration was detected by enzyme-linked immunosorbent （ELISA） method. The changes of Th22 cells and IL-22 factor expression between two groups were compared and observed. Results In lung cancer patients， the expressions of Th22 cells and IL-22 factors were higher than those in the control group（P<0.01）. The correlation analysis chart showed that the two were positively correlated（r=0.631，P<0.01）. And in the experimental group，the values of Th22 cells and IL-22 factors in the lymph node metastasis group were increased compared with those of the non-lymph node metastasis group（P<0.05）. As the tumor diameter gradually increased in the experimental group， the pathological types were different， and the values of Th22 cells and IL-22 factors increased， and the differences were statistically significant（P<0.01）. Conclusion The frequency of Th22 and IL-22 expression in peripheral blood of lung cancer patients was significantly increased， which is closely related to the pathological type of lung cancer， lymph node metastasis， and tumor size. It is expected to add new ideas for the study of lung cancer.
[Key words] Lung cancer; Th22 cells; IL-22 factor; Flow cytometry
原发性支气管肺癌简称肺癌，起源于支气管黏膜上皮及肺泡，是我国及世界范围内发病及死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康[1]，因此探索早期诊断、治疗肺癌对肺癌患
者预后有重要意义。

肿瘤疾病的进展与炎症反应、免疫功能改变相关，炎症反应能够逃避免疫杀伤并且起到促肿瘤的作用[2];近年来，有学者发现Th22细胞是一种新型、独立的CD4+辅助性T细胞亚群，IL-22是其分泌的重要细胞因子，二者在炎症性疾病中的表达增高[3]，在肿瘤疾病中，已有研究表明Th22细胞及其分泌的IL-22因子在肝癌、胃癌、胰腺癌等均有表达[4]，但对于二者与肺癌的关系鲜有报道，因此本研究拟探讨Th22细胞与IL-22效应因子在肺癌发病中的表达情况及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年11月～2019年5月在我院确诊的肺癌患者40例作为实验组，年龄40～83岁，平均（68.2±9.3）岁，男24例，女16例，所有病例均经病理组织学检测确诊为肺癌;健康对照组40例，为同期于我院体检的健康者，其中男28例，女12例，年龄36～80，平均（64.9±11.2）岁。

纳入标准：（1）年龄>18岁;（2）已确诊并明确病理及组织分型的原发性肺
癌患者;（3）既往未接受过放化疗治疗，且未应用免疫抑制剂治疗的患者。

排除标准：（1）有肺结核、肺部急性感染等其他肺部疾病的肺癌患者;（2）有严重心、肝、肾功能有异常的患者;（3）有其他恶性肿瘤史的癌症患者;（4）肿块直径>7 cm的肺癌患者。

实验组40例患者中，肿瘤直径d<2 cm的患者5例，2 cm≤肿瘤直径d<3 cm有10例，3 cm≤肿瘤直径d<5 cm有17例，5 cm≤肿瘤直径d<7 cm有8例，有淋巴结转移12例，无淋巴结转移28例，小细胞癌11例，非小细胞癌29例。

研究资料收集经研究对象知情同意，遵守倫理学的各项规定，两组的性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 仪器及试剂
美国BD公司流式细胞仪、芬兰（Labsystems Multiskan MS）公司352型酶标仪、中国海尔4℃和-20℃冰箱，-80℃超低温冰箱，北京索莱宝科技有限公司人外周淋巴细胞分离液、BD PharMingen、anti-CD4-APC试剂、Biolegend、anti-IL-22-PE，及相应同型对照抗体，莫能霉素及破膜剂均来自美国BD公司，ELISA 检测试剂盒来自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 方法
1.3.1 血液标本的采集用肝素抗凝采血管采集入组患者的静脉血4 mL，用非抗凝普通采血管采集静脉血1 mL，冰盒保存并于1 h内转移至实验中心待用，待血液凝固后，将1 mL全血2500 rpm 4℃离心10 min，取上清液分装于EP管中，每管50 μL，保存于-80℃低温冰箱。

1.3.2 Th22细胞的检测将经过肝素钠作抗凝处理的新鲜采集的外周4 mL全血标本取出，混匀，加入PBS液8 mL，进行稀释;小心提取外周血单个核细胞后，将上述液体孵育4 h后取出孵育板，使用移液器将收集培养箱中细胞，尽量全部吸出，分别转移到2个流式管中，标记为对照管和检测管，加入PBS吹打混匀，1200 rpm×5 min洗涤1遍后弃上清;分别吸取荧光标记的表面抗体，anti-CD4-APC-H7加入检测管中，对照管中加入相应同型对照抗体，充分混匀，静置30 min;2 mL PBS洗涤一次，200 μL的4%多聚甲醛重悬，室温静置20 min后，两管中分别加入1 mL破膜剂，震荡混匀，避光孵育后，分别再向两管中加PBS 5 mL，离心5 min 弃上清，RPMI 1640重悬;向检测管加入细胞内细胞因子抗体anti-IL-22-PE;并向对照管中加入同型对照抗体，充分混匀后，4℃条件下避光孵育30 min;PBS 5 mL洗涤后重悬，将重悬后的细胞液体采用 BD FACSCantoⅡ流式细胞仪上机检测，结果以CD4+IL-22+T细胞在CD4+T细胞中所占百分比进行统计。

1.3.3 IL-22的检测将待测标本及ELISA试剂盒预先从冰箱拿出，并拆除密封袋，核对好所需实验试剂，严格按照酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒操作步骤检测血清中IL-22表达水平，测出OD值绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.4 统计学分析
应用SPSS20.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析;相关性分析采用Pearson相关分析，P
2 结果
2.1 两组Th22细胞和IL-22因子表达水平比较
两组外周血中，Th22细胞（CD4+ IL-22+T）的表达水平见表1：实验组Th22的表达水平明显高于对照组（P<0.01），实验组IL-22表达较对照组升高，差异均有显著性（P<0.01）。

2.2 Th22与IL-22与肺癌患者肿瘤大小、淋巴结转移的关系
由表2可以看出随着肿瘤直径的增大，Th22、IL-22的数值增加，差异具有显著性
（P<0.01）。

肺癌患者中有淋巴结转移者与无淋巴结转移者相比，有淋巴结转移组二者的数值增大，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 Th22、IL-22在不同肺癌病理类型中的表达比较非小细胞癌者与小细胞癌组者比，
Th22细胞、IL-22因子数值增大，差异有统计学意义（P<0.01）。

见表3。

2.4 肺癌患者Th22与IL-22表达相关性分析
由图1看出，Th22细胞与IL-22因子表达呈正相关（r=0.631，P<0.01）。

3 讨论
依据GLOBOCAN估算，2012年全球患有癌症人数可达1410万人，因其死亡人数达820万，其中肺癌是最常见的肿瘤之一，新发病人数可达180万，占癌症总诊断率的13%左右[5]，由此可见肺癌所占较高比率，对于肺癌应更早地诊疗，有助于改善肺癌患者的后期生活质量。

体液免疫和细胞免疫组成了机体的免疫系统，而细胞免疫在抗肿瘤中发挥重要作用，在细胞免疫中起主要作用的效应细胞是CD4+T淋巴细胞[6]。

Duhen T等[7]在2009年发现Th22细胞是一种新型Th细胞，并提出高分泌IL-22细胞因子，因此对于二者的研究越来越多，
Th22细胞及效应因子IL-22因子存在于很多疾病中，在炎症性疾病中，如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、白塞病中，二者均呈高表达[8]，另外其还参与了表皮免疫和修复，有专家指出[9]Th22细胞在机体病毒感染、黏膜免疫反应过程中起到重要作用，因此Th22细胞可能通过某种生物学作用参与肿瘤的发生发展。

在肿瘤系统疾病中，马诗家[10]发现Th22细胞与IL-22因子在原发性肝癌患者外周血中高表达，并指出二者对肿瘤免疫机制及病理过程有调节作用。

Curd LM等[11]实验提出，IL-22在人胰腺癌HPAFII细胞中能够刺激VEGF和免疫抑制细胞因子的生成、引起STAT-3磷酸化，这表示IL-22在人胰腺癌细胞中能促进肿瘤生长。

在乳腺癌的实验中，已有结果表明：IL-22通过促进MAP3K8导致肿瘤发生，且与组织学分级、淋巴结
转移、肿瘤大小、临床分期、Her-2的表达、Ki-67有相关性，Th22细胞、IL-22因子与乳腺癌发病密切相关。

胡云双等[12]研究指出，在细胞处于癌变环境时，Th17与Th22某些因素存在差别时，炎症细胞能够表达相关的变异，进而使IL22+Th17细胞表达上调，在宫颈癌患者组Th17和Th22细胞表达升高，且Th22细胞与CC淋巴结转移相关。

在肺癌研究方面，有学者报道[13]在大、小细胞肺癌中，发现IL-22及其受体IL-22R1的高表达，通过STAT-3通路加速肺癌细胞的生长。

同时杨毅等[14]实验结果提示，Th22、IL-22、1β在非小细胞肺癌患者外周血中表达升高，提示二者可能参与非小细胞肺癌的发生。

大量研究提示，Th22细胞及IL-22因子共同的生物学作用能够参与炎症及免疫抑制的调节，进而促进肿瘤的发生发展，因此设计本次实验，探索二者在肺癌外周血的关系。

本研究结果显示，肺癌患者外周血中，Th22细胞与IL-22因子表达较健康对照者升高
（P<0.01），并且由图1可以看出，二者呈正相关，表示Th22可能通过分泌IL-22因子，間接或直接参与肺癌的发生发展，在肺肿瘤大小中，肿瘤直径越大，Th22的数值越大
（P<0.01），同时IL-22的数值越大（P<0.01），有淋巴结转移的Th22和IL-22数值和无淋巴结转移的数值不同，且有淋巴结转移的数值要大于无淋巴结转移的数值（P<0.05），在病理类型中，小细胞肺癌的Th22和IL-22数值和非小细胞肺癌的数值不同，且非小细胞肺癌的数值要大于小细胞肺癌的数值。

由此可见Th22、IL-22与肺肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型具有相关性，在肺肿瘤的发生发展中起着重要作用，Th22可能促进人类肿瘤疾病的发生、发展，但具体机制还需进一步研究，随着科研工作不断进展[15]，抗肿瘤药物也在不断更新，治疗手段也在不断进步，通过基因检测，预测肿瘤指标，可以针对靶向药物，探索治疗方案，从而调节机体免疫状态，为肺肿瘤疾病的防治策略提供依据。

[参考文献]
[1] 中华医学会，中华医学会肿瘤学分会，中华医学会杂志社.中华医学会肺癌临床诊疗指南（2018版）[J].肿瘤研究与临床，2018，30（12）：793-824.
[2] Oestreich KJ，Weinmann AS.Transcriptional mechanisms that regulate T-helper 1 cell differentiation[J].Curr Opin Immunol，2012，24（2）：191-195.
[3] 任冠颖.乳腺癌外周血Th22、IL-22的表达及与临床分期、Ca153的相关性研究[D].石家庄：河北医科大学，2017.
[4] 马雪梅，李伟东，杨晓东，等.Th22细胞在肿瘤中的研究进展[J].齐齐哈尔医学院学报，2018，39（13）：1563-1565.
[5] Torre LA，Bray F，Siegal RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.
[6] Gulen MF，Kang Z，Bulek K，et al.The receptor SIGIRR suppresses Th17cell proliferation via inhibition of the interleukin-1 receptor pathway and mtor kinase activation[J].Immunity，2010，32（1）：54-66.
[7] Duhen T，Geiger R，Jarrossay D，et al.Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells[J]. Nat Immunol，2009， 10（8）：857-863.
[8] 徐欣欣，孙其乐，王一汀，等.Th22细胞及其效应因子在自身免疫性皮肤病中的作用研究进展[J].中国当代医药，2018，25（25）：43-46.
[9] Levillayer F，Mas M，Levi-acobas F，et al.Interleukin 22 is a candidate gene for
Tmevp3，a locus controlling Theiler’s vieus-induced neurological diseases[J].Genetics，2007，176（3）：1835-1844.
[10] 马诗家.原发性肝细胞癌患者TH22细胞及其细胞因子表达的变化及意义[D].南宁：广西医科大学，2014.
[11] Curd LM，Favors SE，Gregg RK. Pro-tumour activity of interleukin-22 in HPAFII human pancreatic cancer cells[J].Clin ExpImmunol，2012，168（2）：192-199.
[12] 胡云双，周旺展，张颖，等.Th22和Th17细胞在宫颈癌患者外周血中的表达[J].温州医科大学学报，2019，49（3）：210-213.
[13] Kobold S，Volk S，Clauditz T，et al.Interleukin-22 is frequently expressed in small-and large-cell lung cancer and promotes growth in chemotherapy-resistant cancer cells[J].J Thorac Oncol，2013，8（8）：1032-1042.
[14] 杨毅，官俏兵，郭丽，等.IL-1β促进nave T细胞向Th22细胞分化及在非小细胞肺癌中表达的相关性研究[J].中国病理生理杂志，2018，34（7）：1301-1305.
[15] 朱珊珊，陈鑫，颜巧妍，等.抗肿瘤药物的临床应用进展[J].中国现代医生，2019，57（9）：164-168.
（收稿日期：2019-11-01）。