大肠杆菌非中断杂交实验(借鉴材料)

大肠杆菌核酸鉴定实验报告大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，它在人和动物的肠道中起着重要的生理功能。

然而，某些菌株可能会引起食物中毒和感染等健康问题。

对大肠杆菌进行核酸鉴定是非常重要的。

本报告将详细介绍大肠杆菌核酸鉴定实验的过程、结果和分析。

一、实验目的本实验旨在通过核酸鉴定技术确认样品中是否存在大肠杆菌，并进一步了解其亚型和相关特性。

二、实验原理核酸鉴定是通过特定引物与目标DNA序列发生互补配对，借助聚合酶链反应（PCR）扩增目标序列，并通过凝胶电泳分析扩增产物。

在本实验中，我们将使用16S rRNA基因作为靶标序列进行核酸检测。

三、实验步骤1. 样品处理：将待检测样品（如食物、水或环境样品）进行预处理，包括培养基预处理、细胞破碎等步骤，以提取出目标DNA。

2. PCR扩增：设计合适的引物，将目标序列进行PCR扩增。

反应体系包括DNA模板、引物、聚合酶和缓冲液等。

3. 凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，通过电泳分离，根据迁移距离判断是否存在大肠杆菌。

4. 提取目标DNA：从凝胶上切下目标带，使用商业化的基因提取试剂盒进行目标DNA的提取。

5. DNA测序：将提取得到的目标DNA进行测序，并获取测序结果。

四、实验结果经过PCR扩增和凝胶电泳分析，我们观察到了预期大小的PCR产物带。

进一步通过基因提取和测序，我们成功获取了大肠杆菌16S rRNA 基因的序列。

五、实验分析1. 序列比对：将测得的16S rRNA基因序列与已知大肠杆菌参考序列进行比对，可以确定样品中存在的大肠杆菌亚型。

2. 亲缘关系分析：利用已知大肠杆菌亚型构建系统发生树，并将样品中的亚型与之进行比较，以了解它们之间的亲缘关系。

3. 特性分析：通过比对已知大肠杆菌的特性数据库，分析样品中的大肠杆菌可能具有的毒力因子、耐药性等特性。

六、实验结论通过核酸鉴定技术，我们确认了待测样品中存在大肠杆菌，并获取了其16S rRNA基因序列。

分子生物学实验2大肠杆菌感受态细胞的制备第一篇：分子生物学实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备实验大肠杆菌感受态细胞的制备实验原理：转化是将异源DNA分子引入另一细胞系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。

受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，经过CaCl2等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

经过转化的细胞在选择性培养基上，可以筛选出转化体，即带有外源DNA分子的受体细胞。

实验目的：学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。

实验内容：JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂大肠杆菌JM109或DH5α，LB固体/液体培养基，0.1mol/LCaCl2溶液。

二、主要设备台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液器、恒温摇床，等。

三实验方法1.受体菌的培养从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养（300rpm）12小时左右，直至对数生长后期。

将该菌悬液以1：100~1：50（V：V）的比例接种于100ml LB液体培养基，37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35～0.5左右。

2.感受态细胞的制备（1）在无菌条件下，将培养液转入预冷的1.5ml离心管中，冰上放置20min，使其停止生长。

（2）4℃下，4000rpm离心5min，弃去上清。

（3）加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000离心5min。

（4）弃去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，贮存于4℃备用。

或贮存于-70℃（加10-30%的甘油），可保存半年。

四.注意事项：1、整个实验都应在无菌的条件下操作。

2、整个操作均在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低。

第二篇：分子生物学实验讲义实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb 以上不等。

1.本文前期退稿主要原因是写作不清，和编辑郭建秀老师讨论以后，建议根据认真修稿后重新投稿。

2.本课题采用大肠杆菌双杂交的原理如下：
本实验采用新的HIS3-aadA双报告基因。

靶质粒pTRG带四环素（Tet r）抗性基因，诱饵质粒pBT带氯霉素（Cam r）抗性基因。

HIS3编码组氨酸合成途径的一个蛋白，报告菌由于HisB的缺陷，在HIS3没有激活前，不能和3-AT（组氨酸酶3的竞争性抑制剂）竞争利用培养基中地组氨酸，在含有3-AT的平板上不能生长。

只有当蛋白和蛋白相互作用激活HIS3报告基因的转录，才能和3-AT 竞争利用培养基中的组氨酸，可以在含有3-AT的平板上生长，继而激活下游的aadA（编码链霉素抗性基因，Strep r）基因，可以在含有Strep的平板上生长。

如果检测蛋白没有相互作用，只能在非选择平板生长（含Tet，Cam），在选择平板（含Tet，Cm，3-AT）及双选择平板（含Tet，Cm，3-AT，Strep）上不能生长。

只有当HIS3转录激活后才能有足够的能力抵消3-AT的竞争作用，利用培养基中的组氨酸，在含3-AT的培养基上可以生长。

HIS3激活后进一步激活下游的aadA基因，该基因为链霉素抗性基因，可以再含有链霉素的平板上生长。

综上，本实验的结果通过观察子平板上是否生长来判定
诱饵质粒pBT 氯霉素抗性
靶质粒pTRG 四环素抗性
3种平板
非选择平板（含有氯霉素四环素）阴性对照、阳性对照、实验组生长
3-AT平板（含氯霉素四环素3-AT）阴性对照不生长、阳性对照、实验组生长
双选择平板(含氯霉素四环素3-AT 链霉素)阴性对照不生长、阳性对照、实验组
生长。

遗传学实验6 大肠杆菌非中断杂交试验生01 胡璞 2010012345同组成员：王雨川、朱忻怡、廉云实验日期：2012.03.29~04.06一、实验目的1.1学习和了解微生物进行遗传物质传递的几种方法，特别是其中细菌有性杂交的原理。

1.2掌握大肠杆菌杂交的原理，特别是F+，F-和Hfr菌株的异同点，并学会利用非中断杂交法进行基因定位的技术原理和方法。

1.3在掌握上述技能的基础上，完成大肠杆菌非中断杂交的实验，根据结果判断不同目标基因在大肠杆菌基因组中的相对位置，并初步绘制基因图谱。

二、实验原理2.1含有F因子的F+菌株通过接合将F因子传递给F-菌株计量补偿效应是导致多于一条的X染色体失活的原因；2.2不同的Hfr品系中，F因子和主染色体的整合位置不同，染色体的转移是单方向性的，染色体上的基因都是连锁的；2.3位于Hfr染色体上前面的基因将有更多的机会出现在F-中，越是后端的基因出现的机会越少。

因此，根据细菌结合后F-菌中Hfr上基因出现的多少就可测定基因的相对位置；2.4实验中采用选择培养基筛选法筛选不同的重组子。

三、实验材料和用具3.1 实验仪器和用具恒温培养箱、电子天平、超净台、玻璃杯、酒精灯、称量纸、药匙、玻璃平皿、试管、三角瓶、移液器、涂布棒、牙签、蒸馏水、烧杯3.2 实验材料和试剂：3.2.1 菌株供体菌：E. coli CSH60 Hfr str s受体菌：E. coli 57B F-缺陷型（met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-str r）3.2.2 实验试剂液体BP培养基、10XA磷酸缓冲液、生理盐水、糖溶液、硫酸镁溶液、盐酸硫胺素、链霉素溶液、氨基酸溶液、腺嘌呤、选择培养基、A平板培养基。

四、实验过程和步骤4.1 杂交：用取液器分别吸取供体菌0.2 mL，受体菌4 mL混合于一个三角瓶中，置于摇床37 ℃、200 r/min下振荡培养1.5 h；（为的是让供体菌完全杂交）4.2 稀释涂布：将杂交液稀释5倍，从中吸取0.1mL到A平板培养皿上，用涂棒将杂交液涂布均匀，并置于37℃恒温培养箱中倒置培养；4.3 杂交重组体的筛选：由于供体和受体菌在A平板培养基上都不能生长，所以在A培养基上长出的菌落即为重组型的。

一、实验目的1. 探究蛋白质之间的相互作用。

2. 建立蛋白质之间的相互作用模型。

3. 为后续研究蛋白质功能提供实验基础。

二、实验原理细菌双杂交系统是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法。

该系统基于转录活化作用，通过融合蛋白质的合成来检测蛋白质之间的相互作用。

当两种融合蛋白相互结合时，它们可以激活一个报告基因的转录，从而实现对蛋白质相互作用的检测。

三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）。

2. 质粒：pET-28a（载体）、pET-28a-蛋白X（表达蛋白X的质粒）、pET-28a-蛋白Y（表达蛋白Y的质粒）。

3. 试剂：DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA胶回收试剂盒、DNA分子量标准、琼脂糖、LB培养基、IPTG、氨苄青霉素等。

四、实验方法1. 质粒构建：将蛋白X和蛋白Y分别克隆到pET-28a载体上，构建pET-28a-蛋白X和pET-28a-蛋白Y表达质粒。

2. 转化：将构建好的质粒转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆。

3. 表达：将阳性克隆转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，用IPTG诱导表达融合蛋白。

4. 蛋白纯化：采用亲和层析法纯化融合蛋白。

5. 双杂交实验：将纯化的融合蛋白分别与pET-28a-蛋白X和pET-28a-蛋白Y进行双杂交实验，检测蛋白质之间的相互作用。

五、实验结果1. 质粒构建：成功构建了pET-28a-蛋白X和pET-28a-蛋白Y表达质粒。

2. 转化：成功转化了质粒到DH5α和BL21（DE3）中，并筛选出阳性克隆。

3. 表达：成功诱导表达融合蛋白，并通过SDS-PAGE检测到目的蛋白。

4. 蛋白纯化：通过亲和层析法成功纯化融合蛋白。

5. 双杂交实验：在双杂交实验中，蛋白X与蛋白Y之间存在相互作用，表现为报告基因的表达。

六、实验讨论1. 质粒构建：本实验成功构建了pET-28a-蛋白X和pET-28a-蛋白Y表达质粒，为后续实验提供了基础。

遗传学实验报告大肠杆菌非中断杂交实验一、实验结果1、B〜G各培养基菌落数生长情况表一：B〜G各培养基菌落数生长情况（2）阳性菌落数及重组率计算公式：阳性菌落数=阳性+1/2不确定菌落数重组频率=每种选择培养基上的阳性菌落数/点种的总菌落数×100%（3）由上表一可得，将重组频率从大到小排列，板号顺序为FCGBDE。

2、B〜G各培养基中阳性菌落数与基因重组率对应关系:表二：B〜G各培养基基因重组结果对照表由表二可以得出arg，ade，trp，his，lac，gal从近到远的排列顺序为：lac-ade-gal-arg-trp –his；供体菌上基因从近到远的顺序为lac-ade-gal-trp-arg-his。

经试验确认全部大肠杆菌染色体要将基因全部转入到受体菌内需要100min，但由于转移过程中各种条件的影响，接合过程往往不时发生中中断，完整染色体进入受体菌的机会很少；而lac基因距离原点最近，所以最先转入。

随着时间的增长，DNA链变长则容易断裂，举例原点远的基因转入受体菌群的难度增加，所以距离原点最远的his基因基因导入的最少，重组频率最低。

3、由表二数据作大肠杆菌连锁基因图如下图所示图1：实验得到的大肠杆菌连锁基因图图2：大肠杆菌的遗传图示实验所得大肠杆菌基因顺序：lac-ade-gal-arg-trp –his，由图谱所得的基因顺序为：lac-purE-gal-trp-his-arg。

对比大肠杆菌的基因顺序，实验所得的gal与arg的重组频率都为0.29，重组频率相等；而arg基因与his基因顺序相反。

而通过实验结果可以看出两者之间的阳性菌落数及基因重组率相差不大，一个阳性菌落数为26,另一个为21，而实验中人为因素造成的误差较大，也有可能在阳性菌落计数时出现误差，导致试验结果与理论值不符合。

由图可见，前面的基因相对位置都较为符合，而后面的基因因为太远，这种计算方法不是那么适合，实验结果不是很理想。

实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）第一篇：实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）大肠杆菌总DNA的提取实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。

实验目的：1.掌握DNA提取的原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法实验材料：1.实验菌株：大肠杆菌2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：溶菌酶（50mg/ml）5M NaCl氯仿：异戊醇（24：1 v/v）无水乙醇0.8%琼脂糖TAE电泳缓冲液仪器：离心机，电泳仪实验步骤：1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清； 2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C 水浴30min。

5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中；7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min； 8)弃上清，离心管在空气中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。

第二篇：实验四植物DNA的提取[定稿]实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。

采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。

第1篇实验名称：细菌双杂交系统检测蛋白质相互作用实验日期：2023年X月X日实验者：[实验者姓名]实验目的：1. 利用细菌双杂交系统，检测目标蛋白质A与蛋白质B之间的相互作用。

2. 验证蛋白质A与蛋白质B形成复合物的可能性。

实验原理：细菌双杂交系统是一种基于转录激活作用的蛋白质相互作用研究方法。

该系统利用大肠杆菌中的转录因子和报告基因的相互作用，通过检测报告基因的表达情况来判断蛋白质之间的相互作用。

实验原理如下：- 将目标蛋白质A与转录因子GAL4的DNA结合域（DBD）融合，形成融合蛋白A-DBD。

- 将目标蛋白质B与转录因子GAL4的激活域（AD）融合，形成融合蛋白B-AD。

- 当A-DBD与B-AD相互作用时，B-AD可以激活报告基因的表达。

- 报告基因的表达情况可以通过检测其产物（如β-半乳糖苷酶）的活性来评估。

实验材料：- 大肠杆菌菌株：如DH5α、BL21（DE3）等。

- 载体：如pET-28a、pGADT7等。

- 目标蛋白质A和B的克隆载体。

- 限制性内切酶：如EcoRI、BamHI等。

- DNA连接酶：如T4 DNA连接酶等。

- 转化试剂：如CaCl2、感受态细胞等。

- DNA标记物：如λ-DNA、pUC19等。

- 质粒提取试剂盒。

- β-半乳糖苷酶检测试剂盒。

实验步骤：1. 克隆构建：- 使用限制性内切酶EcoRI和BamHI切割目标蛋白质A和B的克隆载体，并连接到pET-28a和pGADT7载体上，分别得到pET-A和pGAD-B。

- 使用PCR技术扩增目标蛋白质A和B的编码序列，并克隆到pET-A和pGAD-B 载体上。

- 使用质粒提取试剂盒提取质粒。

2. 转化：- 将pET-A和pGAD-B质粒转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆进行培养。

3. 蛋白质表达：- 将阳性克隆转化到BL21（DE3）中，使用IPTG诱导表达融合蛋白A-DBD和B-AD。

4. 报告基因活性检测：- 收集表达融合蛋白的细菌，提取细菌裂解物。

大肠杆菌酵母双杂交技术在药物研发中的应用近年来，药物研发热度不断上升，由于药物研发周期漫长、费用巨大以及复杂性高等等，科学家一直在探索更为有效的药物研发方法。

大肠杆菌酵母双杂交技术就是其中一种被广泛应用的技术之一，其在药物研发中发挥了重要作用。

一、双杂交技术的基本原理大肠杆菌酵母双杂交技术是一种研究蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法。

其基本原理是利用酵母双杂交法可以较为有效地检测到蛋白质之间的相互作用关系。

该技术的方法流程为：将待测蛋白质的基因插入酵母中，然后将另一种蛋白质的基因插入另一条不同的质粒中，使其转化到同一酵母细胞中，如果这两个蛋白质存在相互作用，就会诱导激活酵母中的特定基因，同时使其产生对生长选型有影响的特定代谢物，从而在生长培养基中生长出较为鲜明的克隆斑点，证明这两种蛋白质之间具有相互作用；反之，如果不存在相互作用，则无法激活特定基因，无法生长出鲜明的克隆斑点。

通过筛选和确认这些由蛋白质-蛋白质相互作用导致的酵母克隆斑点，科学家们能够进一步研究这些生物分子间相互作用的本质，从而更好地理解其在生物体内的功能和作用。

二、双杂交技术在药物研发中的应用大肠杆菌酵母双杂交技术被广泛应用于药物研发领域，它可以被用来研究蛋白质之间的相互作用，从而发现具有治疗作用的新型分子。

除此之外，双杂交技术还可以用于药物靶点发现、新药筛选、药物副作用分析等方面。

1. 药物靶点发现药物靶点发现是针对某一疾病或症状寻找适合的治疗蛋白质，从而进行特异性治疗。

通过大肠杆菌酵母双杂交技术可以发现与靶蛋白相互作用的蛋白质，比如肿瘤蛋白、膜传递物、酶等等，为药物研发提供重要参考。

2. 新药筛选通过对活性物质与其可能参与的酶和蛋白质进行结合实验，可以筛选出合适的药物,即对某种病原体有有效作用，而对宿主细胞无毒性的分子，该技术可用于病原体和癌症细胞的新药筛选。

3. 药物副作用分析药物的安全性是药物研发过程中必须考虑的因素之一，而大肠杆菌酵母双杂交技术可用于药物的副作用分析。

大肠杆菌非中断杂交实验大肠杆菌非中断杂交实验一、实验目的1．了解细菌有性杂交的原理，学习合作实验，熟悉点菌。

2．掌握利用非中断杂交法进行基因定位的原理，并利用实验结果进行分析。

二、实验原理F+菌株：带有F因子的菌株F-菌株：不带F因子的菌株Hfr品系：F因子整合入细菌染色体F’菌株：由Hfr菌株染色体中F因子的不正常环出造成F’因子含有供体细胞的特定基因其中，带有F因子的菌株能够与不带F因子的菌株（F-菌株）进行杂交进而发生基因重组。

F因子一般游离于细菌染色体之外，也可能整合到染色体上，因此是一种被称为附加染色体的质粒。

带有F因子的细菌，细胞表面会形成一种与细胞接合作用相关的毛状突起，被称为性纤毛，长约1-20μm。

性纤毛促使供体和受体细胞特异地配对，在受体细胞上有纤毛的特异结合位点，当性纤毛结合到这些特异性位点之后，开始收缩并将2个细菌拉拢形成作为遗传物质转移通道的接合管，遗传物质的转移就开始了。

F+菌株和F-菌株杂交发生基因重组的频率约为10-7；Hfr品系，其和F-菌株杂交时发生重组的频率为10-4；通过F’因子介导的供体菌向受体菌特定基因的转移被称为性导。

在杂交过程中，接合细菌可以在2小时中缓慢地进行遗传物质的传递，在杂交不同时间进行强力搅拌，打断接合细菌之间的接合管，从而终止遗传物质的转移。

所以对应于转移起点越近的基因进入受体菌的几率越大，因此可以通过绘制基因的转移曲线推断出基因顺序并以时间为单位进行染色体作图，这种方法就是中断杂交作图。

本实验采用的是非中断杂交，不同的高频重组品系（Hfr）中F因子与主染色体的整合位置是不同的。

Hfr菌株与F-菌株进行结合，染色体由Hfr向F-转移，由于染色体的转移是单方向性的，染色体上的基因都是连锁的，所以，位于Hfr染色体上前面的基因将有更多的机会出现在F-中，越是后端的基因出现的机会就越少。

因此，根据细菌结合后F-菌中Hfr 上的基因出现的多少就可以测定基因间的相对位置。

大肠杆菌实验报告大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063 阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。

但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。

在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。

当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。

如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。

DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。

紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。

因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。

一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。

选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。

本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。

若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。

在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml Ph7.0 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。

一、实验目的1. 掌握杂交中断实验的基本原理和方法。

2. 了解中断杂交技术在基因定位中的应用。

3. 通过实验，加深对基因连锁和交换规律的理解。

二、实验原理1. 中断杂交实验是利用物理手段使Hfr（高频率重组）与F-（非重组）细胞杂交过程中，Hfr细胞染色体转移任意中断，从而得到不同基因组合的重组体。

2. 通过分析重组体中基因出现的先后顺序，可以推断出基因在染色体上的相对位置，进而进行基因定位。

三、实验材料与器具1. 菌株：Hfr：thr-leu-azi-Ston-Slacgal-strs，F-：thr-leu-aziR-tonR-lacgal-strR2. 培养基：含有链霉素的培养基3. 实验器具：培养皿、食物搅拌器、移液器、显微镜等四、实验步骤1. 将Hfr和F-菌株分别培养至对数生长期。

2. 将两种菌株混合培养，每隔一定时间取样。

3. 将菌液放在食物搅拌器内搅拌，以中断接合。

4. 将中断接合的细菌接种到含有链霉素的培养基上。

5. 观察并记录形成重组体的种类及数量。

五、实验结果与分析1. 重组体种类：thr-leu-aziR-tonR-lacgal-strs2. 重组体数量：8个3. 重组体出现时间：thr（8分钟）、leu（9分钟）、aziS（10分钟）、ton（12分钟）、lac（14分钟）、gal（16分钟）、str（18分钟）根据实验结果，可以推断出基因在染色体上的相对位置如下：thr-leu-aziS-ton-lac-gal-str六、实验讨论1. 中断杂交实验中，Hfr细胞染色体转移的方向性及随机性是实验成功的关键。

2. 实验过程中，食物搅拌器的使用对于中断接合至关重要。

3. 通过观察不同重组体的出现时间，可以推断出基因在染色体上的相对位置。

七、结论本次实验成功进行了杂交中断实验，并通过分析实验结果，确定了基因在染色体上的相对位置。

实验结果符合基因连锁和交换规律，验证了中断杂交技术在基因定位中的应用。

分离划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。

涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。

（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml（配固体培养基再加琼脂20克）2、流程计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板培养基配制(特)培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。

待灭菌。

①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。

②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。

③包扎：用_牛皮纸__或报纸④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _.2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。

再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀。

4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。

5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。

灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。

⑤倒平板、制斜面操作平台：超净台灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外线 _和_过滤风，灭菌30min.倒平板：待培养基冷却至__60_ ℃时，将每只培养皿倒入_10~12_ml未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。