抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

2019年第7期 吉林畜牧兽医·经验交流·JingYan JiaoLiu口蹄疫病毒抗体检测白 翠，王 楠，王 晶，马晓媛，于钦磊吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062摘 要：口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病，是由口蹄疫病毒引起的，常常发生在偶蹄动物，偶尔也见于人和其它动物。

世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病，我国将其列为一类动物疫病。

我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病，疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段，也可以根据免疫后的 效果来制定合理免疫程序。

本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。

关键词：口蹄疫；ELISA；抗体检测我国口蹄疫病毒流行毒株主要为A型、亚洲I型和O型，其中O型口蹄疫病毒基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展[1]。

1 液相阻断ELISA方法进行抗体检测液相阻断是应用双抗体夹心法，其试验过程是抗原吸附在载体上，也就是我们常说的包被，包被后加入待测抗体，反应后加相应酶标记抗体，生成抗原抗体复合物，再与底物发生显色反应。

最后通过酶标仪的光谱吸收，测量OD值，计算抗体的量。

本实验室的试剂盒主要是使用兰州兽医研究所（兰兽研）研制开发的，该试剂盒与其它同类型试剂盒相比，许多项指标都已达到了世界口蹄疫参考实验室的同类产品水平，符合率极高。

液相阻断的难点重点在于被检血清的稀释倍数，这个在试剂盒说明书上有具体操作步骤，实验室操作人员可根据说明书进行10份或20份样品的操作。

2 3ABC非结构蛋白抗体检测经抗原纯化过的口蹄疫疫苗，去除了绝大部分3ABC非结构蛋白[2]，因此，用灭活疫苗免疫的健康动物体内正常不会有3ABC非结构蛋白抗体产生，而自然感染的动物体内由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大，不仅产生了结构蛋白而且也产生3ABC非结构蛋白抗体。

所以，用该方法可以区分自然感染和免疫抗体。

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、烈性、高度接触性动物传染疫病，具有宿主范围广、传播快、危害巨大等特点，位居世界动物卫生组织（OIE）规定的A类动物疫病之首，我国也列为一类动物疫病，对畜牧业发展和公共食品安全危害巨大。

目前绝大多数国家和地区仍然采取以灭活疫苗免疫为主的防控措施，所以有效抗原含量的高低直接决定口蹄疫疫苗的品质和免疫后特异性抗体水平的高低。

口蹄疫疫苗的生产环节必须严格遵守药品生产质量管理规范（GMP）标准对各个生产工艺环节实行全程追踪，包括细胞密度与活力、病毒的接种与收获、灭活、浓缩纯化、乳化与分装等，对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗抗原量的监督控制。

目前，国外对于疫苗品质的评判主要是检测疫苗的PD50，鉴于我国对口蹄疫采取国家强制免疫的防控措施，每年检测口蹄疫疫苗PD50所需要的靶动物量较大，并且符合PD50检测需要的靶动物也比难购买，因此迫切需要建立一种能高效批量检测口蹄疫灭活疫苗生产中有效抗原含量的实验室检测技术，实时对疫苗生产各环节抗原含量进行有效监控，建立与疫苗效力检验PD50的相关性，切实为加快我国对口蹄疫的防控与净化保驾护航。

目前，对于口蹄疫灭活疫苗抗原含量检测的技术包括以下几种：一酶联免疫吸附技术（ELISA）主要是采用双抗体夹心法进行检测，首先使用纯化的口蹄疫病毒抗原免疫BALB/C小鼠，取抗体效价到达要求的小鼠脾脏分离脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）经PEG-4000进行细胞融合，并利用有限稀释法进行3-5次亚克隆，筛选出阳性值高、分泌稳定且特异性强的杂交瘤细胞株扩大培养并及时冻存，大量制备腹水型单克隆抗体并进行纯化，利用抗体亚型鉴定试剂盒对收集的腹水型单抗进行亚型鉴定，利用间接免疫荧光技术（IFA）对制备的单克隆抗体进行验证，同时建立病毒抗原与腹水型单抗之间的线性关系。

一、口蹄疫疫苗口蹄疫疫苗是由强毒接种悬浮培养BHK-21细胞，收获细胞毒液，经二乙烯亚胺(BEI)灭活，与油佐剂混合乳化制成的灭活疫苗，同时灭活疫苗是目前我国用于预防口蹄疫的主要产品。

二、疫苗制苗毒株口蹄疫病毒抗原性多变，各血清型间无交叉免疫性。

同一型内又存在多种不同毒株，它们之间也有明显的抗原差异，有的能够提供部分交叉保护，有的完全不能。

目前，国际上普遍采用细胞中和试验或ELISA方法计算r值，以此反映毒株间的抗原关系。

r值愈接近1，毒株间抗原关系愈靠近；反之，抗原关系疏远，毒株差异较大。

r值是反映了一个毒株的抗血清对另一个毒株抗原的交叉反应程度。

通过我国口蹄疫流行变化来看，病毒往往发生变异之后，原有的疫苗株对新的流行毒株没有保护或保护力下降。

因此，所选疫苗毒株必须与流行毒株在抗原特性上相互匹配，免疫才能有较好的效果。

三、口蹄疫疫苗146S口蹄疫疫苗146S，即完整的病毒颗粒，口蹄疫完整病毒颗粒和组装体在蔗糖密度梯度中的沉降系数有所不同。

完整病毒粒子的沉降系数为146S，无核酸的空衣壳沉降系数为75S，由VP0、VP1和VP3各5 个分子组成的五聚体沉降系数为12S，由VP0、VP1和VP3各一分子组成的单体沉降系数为5S。

完整的病毒颗粒以及降解产物空衣壳（75S）可引起较好的免疫保护效力，对于体液免疫，尽管12S和5S结构蛋白免疫原性较弱，但两者仍具有细胞免疫和免疫增强的作用，可提高免疫应答水平[1]。

根据146S的生化特性，现阶段可采用蔗糖密度梯度离心法、单克隆抗体夹心ELISA定量法、分子排阻色谱法、蛋白层析法等方法测定口蹄疫病毒抗原含量，但目前还没有能够检测刺激机体产生抗体的75S含量的方法，同时国家对口蹄疫疫苗146S的含量以及检测方法均没有相关标准和要求，不同企业、不同检测机构使用的检测方法不同，检测结果也会有差异，虽口蹄疫灭活疫苗以体液免疫为主，但细胞免疫水平也是衡量疫苗免疫效力的重要指标，所以检测146S含量不能完全体现疫苗的免疫效力。

口蹄疫的诊断及防治方法前言口蹄疫病毒(foot and mouth disease，FMDV)作为人畜共患的急性接触性传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。

在国际贸易日趋繁荣、物资交流和旅游活动日益便捷的情况下，很多国家都有可能再度遭到口蹄疫的侵袭。

口蹄疫严重危害畜牧业的发展，给牧区造成严重的经济损失，也可使对外贸易和旅游业遭受惨重损失。

全世界每年由此造成的经济损失可达数百亿美元，口蹄疫的暴发已经影响到国际关系、国家名誉和经济发展，在某些流行过程中病毒还可发生变异，也给防控和消灭口蹄疫带来困难。

【摘要】由口蹄疫病毒引起的偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病。

本病传染性极强，发病率几乎达100%，往往造成广泛流行，引起巨大的经济损失和社会影响。

了解其病毒的本质和流行规律、病源及传播方式、临床诊断的表现及防治措施等对该病的控制有现实意义。

本文对其国内外的研究做一综述，为口蹄疫的防治工作提供基础依据。

【关键词】口蹄疫流行诊断防治【正文】1.口蹄疫(FMDV)的简介口蹄疫病毒(FMDV)属微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，有个血清型和65个以上的亚型。

是引起多种动物发生口蹄疫的病原。

1.1病毒特性病毒颗粒呈球形，二十面体对称，无囊膜，核酸类型为单股正链RNA，核酸分子量2.4～2.8-l×106d，长2.62um，呈细丝状，有感染性，并能起而RNA作用。

病毒在胞浆内增殖。

FMDV具有四种主要多肽，即VP1、VP2、VP3、VP4。

FMDV在血清学上分为7个型，即A、O、C、SAT，(南非1型)、SAT2(南非2型)、SAT3(南非3型)和AsiaⅠ(亚洲1型)，每一型又有许多亚型。

目前7个型至少可分为65个亚型，其中A型有32个，O型有11个，C型有5个，SAT1有7个，SAT2有3个，SAT3有4个，Asia I有3个。

各型间无交叉免疫原性，在同型内的亚型间有部分交叉免疫原性。

病毒型和亚型的鉴定主要根据抗原差异，不同型之间完全没有抗原关系，可用各型标准血清来鉴定病毒型。

不同品牌 ELISA试剂盒对口蹄疫抗体检测的试验摘要：用不同品牌的口蹄疫O型ELISA试剂盒,对免疫口蹄疫疫苗后的猪群进行口蹄疫抗体检测，发现检测结果阳性率各不相同。

结果表明不同品牌试剂盒因制备方法、包被抗原不同对猪群的抗体检测结果不同，所以，建议在实践中用口蹄疫ELISA试剂盒检测抗体效价应根据情况有选择使用。

关键词：试剂盒；抗体效价检测；阳性率；有选择使用；口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus）引起的偶蹄动物烈性传染病，是世界卫生组织（OIE）规定必报的烈性传染病，我国将其排在一类传染病之首。

口蹄疫病毒共有七个血清型，分别为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3型。

每个血清型又有许多不同的亚型，各血清型之间没有交叉保护，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉保护，这使得对口蹄疫的防控更加困难。

目前我国主要流行O型和A型口蹄疫。

目前，我国防控口蹄疫主要采取疫苗免疫与扑杀相结合的综合防治措施，对所有易感动物猪、牛、羊进行口蹄疫灭活疫苗免疫接种。

但是在给动物注射疫苗后能否预防口蹄疫的发生一直的广大养殖户迫切需要知道的问题。

所以免疫后的效果评价就显得特别重要。

目前主要有以下几种检测方法：1.免疫动物攻毒实验；这一方法是判断疫苗免疫效果的金标准，但因需要在生物安全三级实验室内进行，一般养殖企业和研究单位都没法实施。

2.免疫动物血清中和实验；这一方法相对准确些，但同样也受一定条件限制，一般的研究检测单位也不完全具备检测条件。

3.免疫动物血清ELISA抗体检测；这一方法的准确性比前两种方法相对较差，但也是一般检测单位都容易实施的检测方法，因此也被广泛用于疫苗免疫效果的评价。

但由于这一方法的存在的一定的缺陷，评价结果也一直存在争议。

本文所研究的就是使用第三种方法对疫苗免疫效果进行检测，根据检测结果进一步分析这一方法的准确性，对使用单位给予一些指导建议。

一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。

现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。

1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。

病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。

中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。

病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。

2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。

灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。

当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。

然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。

中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。

2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。

目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。

硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。

【动科前沿】⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫诊断检测技术正在不断改进和创新，已从细胞培养、⾎清学诊断技术扩展到分⼦⽣物学诊断技术领域。

这些新技术不仅敏感、特异、⽽且简便、快速、经济、⾼通量化。

⼀、病原学检测技术1新的敏感细胞系因⽜甲状腺原代细胞和羔⽺原代细胞在⽣产上存在问题，尤其是很少进⾏⼝蹄疫诊断的实验室及因⼝蹄疫呈地⽅流⾏性的地区，很难得到⼝蹄疫阴性的动物。

⽽现有的细胞系对⼝蹄疫敏感性存在局限性，因此，研究者对⼝蹄疫毒更加敏感的细胞系的进⾏了研究。

Brehm等建⽴了⾼敏感⼭⽺胎⼉细胞系，结果表明，在分离7个⾎清型的⼝蹄疫病毒更加敏感。

并且该细胞还可以分离猪⽔泡病毒和⽔疱性⼝炎病毒。

LaRocco(2013)年将αv亚基和β6亚基同时导⼊到⽜肾细胞系中构建稳定表达细胞系LFBK-αvβ6,结果表明β6亚基⾄少在100代可以稳定表达，且增强了对⼝蹄疫病毒的易感性。

2分⼦⽣物学诊断技术2.1环介导转录等温扩增技术⼝蹄疫的传统诊断⽅法是由特异性病毒抗原的酶联免疫吸附试验检测所介导的，通过观察细胞培养中的病变效应。

另外，常规反转录聚合酶式反应和实时定量聚合酶式反应⽤来补充⼝蹄疫病毒感染的最初诊断⽅法。

然⽽，这些检测⽅法⽐较费⼒，并且需要昂贵的试验室设备。

为解决这些问题，Yamazaki等⼈建⽴了⼀个简单、快速和实⽤的反转录的环介导等温扩增⽅法鉴定动物及其产物中的⼝蹄疫病毒。

反转录环介导等温扩增⽅法⾸先是由Notomi等⼈报道的，并且成功应⽤于许多病毒的检测，李健等利⽤环介导等温扩增技术建⽴了⼝蹄疫快速检测⽅法，同时评价了该⽅法的灵敏性和特异性。

该检测⽅法检测体系具有极⾼的特异性，只能检测到⽬标病毒，与其他类病毒物较差反应，灵敏性较⾼。

2.2实时荧光定量反转录聚合酶链式反应荧光实时定量聚合酶链式反应就是通过对聚合酶链式反应扩增反应中的每⼀个循环产物荧光信号的实时监测，从⽽实现对起始模板定量及定性分析。

口蹄疫亚洲I型液相阻断ELISA抗体检测试验一、适用范围：试剂盒来自中国农业科学院兰州兽医研究所，适用于A型和亚洲I型口蹄疫抗体检测。

二、器材准备：1．移液器：5-50μl移液器、0.2-10μl移液器、50-200μl移液器、50-300μl移液器各一把。

2．抗原抗体反应板：微量血凝板（U型、V型均可）若干块，用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。

3．水质要求：无离子水或蒸馏水均可。

三、试剂准备：1．包被缓冲液（PH9.6）将试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末小心倒入100ml无离子水中溶解即可。

4℃存放，1月内有效。

2．洗涤液（PBST）将本试剂盒配备的25倍浓缩PBST液（可能有结晶形成，用时微热溶化）用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。

（如果PH降低，务必用NaOH调制7.4）3．底物溶液取1片柠檬酸-磷酸盐片剂（试剂盒配备）溶于100ml无离子水中，溶解后，取50ml 溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装（5ml/瓶或10ml/瓶），避光-20℃保存。

用前避光溶化，临用时每1ml上述溶液加10μl3%的双氧水（H2O2）。

务必加双氧水！四、操作步骤：1．用包被缓冲液稀释亚洲I型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:1000）,在ELISA 板上每孔加50μl，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。

2．抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应根据不同的需要，选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。

图1 96孔酶标板检测10份样品布局图ABCDEFGH图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图；图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。

图2 96孔酶标板检测20份样品布局图1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH以图1为例，在U型血凝板上按50μl/孔量用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。

同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50μl用PBST稀释到使用浓度的亚洲I型口蹄疫病毒抗原（稀释浓度以试剂盒说明书为准），病毒抗原对照孔加100μl。

国家口蹄疫参考实验室诊断检疫技术简介（一）现有诊断检疫技术（试剂盒）本实验室经过多年的研究和实践，建立了病毒分离、补体结合试验（CFT）病毒中和试验（VNT）、血清中和试验等诊断方法，并形成了一套完善的诊断程序，符合国际通用的操作标准。

同时发展了O型口蹄疫正向间接血凝诊断法，口蹄疫和猪水泡病反向间接血凝诊断法，琼脂扩散试验，以及口蹄疫VIA诊断和RT-PCR诊断试剂盒，满足口蹄疫样品的诊断和定型。

近年来，本实验室根据科学技术发展，结合国际组织推荐的口蹄疫诊断检疫技术，研制出了多种试剂盒和检测方法。

1、O型口蹄疫液相阻断ELISA诊断试剂盒液相阻断ELISA是国际兽疫局（OIE）推荐的检测口蹄疫病毒抗体的标准方法。

用分离于我国的口蹄疫O型毒株研制出液相阻断ELISA试剂盒，用于测定牛、猪、羊血清中针对O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体。

本试剂盒主要用途，一是对进出口动物口蹄疫病毒抗体监测；二是监测口蹄疫疫苗免疫抗体，以评价动物群体抗感染能力。

2、口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒（3ABC-I-ELISA）区分口蹄疫感染和免疫动物是国际活畜进出口贸易的必检项目，也是OIE 判定疫情国家和非疫情国家的依据。

本试剂盒适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，检测活畜血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体，以区分感染和免疫动物。

本试剂盒可测出牛感染后长达480天（16个月）的感染抗体，其多项技术指标已超过国外同类产品。

3、口蹄疫多重RT-PCR诊断试剂盒（FMD Multi RT-PCR）本试剂盒适用于病料诊断、反刍活畜和肉品等畜产品染毒检测，特异性扩增病料、O/P液和肉品中的口蹄疫病毒基因片段，确认样品供体是否染毒。

本试剂盒含有三对引物，可扩增多个口蹄疫病毒基因片段，至少适用于口蹄疫O型、A 型和AsiaⅠ型的三个血清型的检测，可查出0.07LD50的病毒量。

4、口蹄疫原位杂交检测法原位杂交是借助核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核酸片段。

摘要：口蹄疫是我国比较多发的一类动物疫病，口蹄疫的检测诊断是做好口蹄疫防控工作的关键。

为了更好更快地检测和诊断口蹄疫，本研究在口蹄疫血清3ABC 检测阳性的基础上尝试建立一种快速灵敏的PCR 检测技术。

通过查询基因序列、引物设计、引物合成、PCR 反应条件摸索和优化、PCR 扩增、凝胶电泳成像，最终在待测样品中成功地扩增出A 型口蹄疫病毒预期大小的条带，可以快速检测出A 型口蹄疫病毒。

O 型和Asia I 型因没有阳性病原学样品或标准毒株，未能扩增出相应的目的条带。

关键词：口蹄疫；检测技术；聚合酶链式反应（PCR ）口蹄疫PCR 检测技术的建立张红梅1，王雅媛2,3，曹文琴1，白崇生1*，权富生3*（1.榆林市畜牧兽医服务中心陕西榆林719000；2.榆林市农业宣传信息中心陕西榆林719000；3.西北农林科技大学陕西杨凌712100）doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.003收稿日期：2022-12-10作者简介：张红梅（1981.7—），女，陕西榆阳人，本科，兽医师，主要从事畜牧兽医相关工作。

*通信作者口蹄疫（foot-and-mouth disease ，FMD ）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV ）引起的一种急性、烈性、水泡性病毒传染病，主要感染牛、羊、猪等70多种偶蹄科动物，典型的临床特征主要表现为机体发热，口腔黏膜、唇部、蹄部及乳房皮肤出现烂斑或水疱性病理变化[1-3]。

FMD 被世界动物卫生组织（WOAH ）和联合国粮农组织（FAO ）列为A 类传染病的首位。

我国亦将FMD 排在动物疫病病种名录的第一位[4]。

FMD 的诊断技术从大的方面分为临床诊断和实验室诊断。

单纯的临床诊断不能作为FMD 确诊的依据[5]。

目前，检测技术方法虽然层出不穷，但是，由于FMD 血清型种类繁多和FMDV 很容易发生变异，给本病诊断带来一定困难。

检测口蹄疫血清抗体的方法〔一〕口蹄疫正向间接红细胞凝集试验〔间接血凝试验〕该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物〔细胞毒〕经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料 V型96孔110。

医用血凝滴定板、玻璃板〔与血凝板大小相同〕、微量移液器〔10~100微升〕、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管〔内径1.5毫米，长度100毫米〕、铝质试管架〔40孔〕、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升参加第1孔，混匀后从中取出50微升参加第2孔，混匀后从中取出50微升参加第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。

此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升参加第1管混匀后从中取出0.5毫升，参加第2管混匀后从中取出0.5毫升，参加第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升参加血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升参加第11孔；取稀释液50微升参加第12孔。