高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201380029894.0
(22)申请日 2013.06.05
10-2012-0060641 2012.06.05 KR
10-2013-0063053 2013.05.31 KR
C07K 14/61(2006.01)C07K 19/00(2006.01)C07K 1/16(2006.01)(71)申请人CJ 医药健康株式会社
地址韩国首尔
申请人阿特根公司
(72)发明人姜佶扶 李庭旼 安智远 李东亿
田昌奉 李元祯 赵诚唯 朴芝彗金起完 李允庭 文智铉 吴厚根朴映准 李尙贤 林亨泽 朴淳宰郑惠信 李尙美(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人赵蓉民
张全信(54)发明名称
高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产
方法
(57)摘要
本发明涉及一种高度糖基化并在体内高度长
效的长效人生长激素NexP-hGH 蛋白，以及涉及其
制备方法。

更具体地，本发明涉及长效人生长激
素NexP-hGH 蛋白的具体同种型，其中人生长激素
与高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突变体融合，从
而增加体内长效性能，并涉及其生产方法。

在考虑
持续性人生长激素产生方法的范围内，本发明也
涉及用于NexP-hGH 的高纯度纯化方法，该方法具
体包含以下步骤：(a)对包含其中人生长激素与
α-1抗胰蛋白酶突变体融合的长效人生长激素
NexP-hGH 的生物乳液进行阴离子交换树脂色谱；
(b)对该包含NexP-hGH 的生物乳液或步骤(a)中
产生的洗脱物进行疏水树脂色谱；和(c)对该包
含长效人生长激素NexP-hGH 的生物乳液和步骤
(a)或步骤(b)中产生的洗脱物进行亲合色谱，该
亲合色谱装填了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片
段的树脂。

(30)优先权数据
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2014.12.05
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/KR2013/004985 2013.06.05
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2013/183948 KO 2013.12.12(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书2页 说明书13页序列表2页 附图7页(10)申请公布号CN 104379598 A (43)申请公布日2015.02.25
C N 104379598
A
1.一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更低的等电点(pI)。

2.权利要求1所述的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中所述α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)包含至少一个选自下述的突变：野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第9个残基上谷氨酰胺至天冬酰胺的突变、野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第232个残基上半胱氨酸至丝氨酸的突变、野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第357个残基上脯氨酸至天冬氨酸的突变和野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白第359个残基上丝氨酸至苏氨酸的突变。

3.一种制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及
(b)根据等电点(pI)差异分离具有5.2或更低的等电点(pI)的所述长效人生长激素NexP-hGH蛋白。

的Tris缓冲液
4.权利要求3所述的方法，其中步骤(b)包括用含0至1000mM MgCl
2
洗脱所述长效生长激素NexP-hGH蛋白。

5.权利要求4所述的方法，其中所述Tris缓冲液包含200mM MgCl
2
6.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)是通过将包含所述长效人生长激素NexP-hGH 蛋白的样品施加到阴离子交换树脂色谱或疏水树脂色谱而产生的洗脱物施加到所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱的步骤。

7.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)是通过将包含所述长效人生长激素NexP-hGH 蛋白的样品依次施加到阴离子交换树脂色谱和疏水树脂色谱而产生的洗脱物施加到所述填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱的步骤。

8.根据权利要求3至7任一项制备的长效人生长激素NexP-hGH蛋白。

9.一种纯化长效人生长激素NexP-hGH的方法，所述方法包括：
(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；
(b)将所述包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和
(c)将所述包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。

10.权利要求9所述的方法，其中步骤(a)是以下的步骤：将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或通过将所述培养物液体培养基用具有6至9的pH、包含0至100mM NaCl 的缓冲液透析过滤获得的经透析过滤的培养物液体培养基施加到平衡的阴离子交换树脂以吸附于其上；用具有pH 6至9、包含0至100mM NaCl的缓冲液冲洗所述树脂；和用具有pH 6至9、包含100至1,000mM NaCl的缓冲液洗脱包含所述长效人生长激素NexP-hGH的部分。

11.权利要求9所述的方法，其中步骤(b)是以下的步骤：将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或从所述阴离子交换树脂色谱回收的溶液施加到平衡的疏水树脂以吸附于其上；用具有pH 6至8、包含1至3M NaCl的缓冲液冲洗所述树脂；和用具有pH 6至8、
包含0至1M NaCl的缓冲液洗脱包含所述长效人生长激素NexP-hGH的部分。

12.权利要求9所述的方法，其中步骤(c)是以下的步骤：将包含长效人生长激素的培养物液体培养基或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到平衡的附着了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂以吸附于其上；用具有6.5至8.5的pH、包含0至200mM NaCl的Tris缓冲液冲洗所述树脂；和用具有6.5至8.5的pH、包含0至1M MgCl2的缓冲液洗脱包含所述长效人生长激素NexP-hGH的部分。

13.权利要求9所述的方法，进一步包括步骤(d)，在用所述填充了附着抗α-1抗胰蛋
分离和洗脱具有不白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱的纯化工艺中，用0至1000mM MgCl
2
同多糖模式和等电点的所述长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型。

14.权利要求13所述的方法，其进一步包括用0至2000mM NaCl代替MgCl
分离和洗
2
脱具有不同多糖模式和等电点的所述长效人生长激素NexP-hGH的结构同种型。

15.权利要求10至12任一项所述的方法，其中用于冲洗或洗脱的所述缓冲液是磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或Tris缓冲液。

16.权利要求9所述的方法，其中所述生物流体是动物细胞的培养物液体培养基。

17.权利要求9所述的方法，其中所述阴离子交换树脂的官能团是选自季胺(Q)、二乙基氨乙基(DEAE)和季氨基乙基(QAE)的任一个。

18.权利要求9所述的方法，其中所述疏水树脂色谱的官能团是选自苯基、辛基、异丙基、丁基和乙基的任一个。

高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及在体内被高度糖基化并高度长效的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，及其制备方法。

更具体地，本发明涉及长效人生长激素NexP-hGH蛋白的一种具体同种型，其中人生长激素与高度糖基化的α-1抗胰蛋白酶突变体融合，及其制备方法。

[0002] 该长效人生长激素的制备方法也涉及一种高纯度纯化NexP-hGH的方法，具体地包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；(b)将包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和(c)将包含该长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。

背景技术
[0003] 通常，天然型人生长激素(hGH)由191个共具有约21500道尔顿的分子量的氨基酸组成。

人生长激素从垂体前叶分泌，并且在体内促进骨和软骨生长。

生长激素缺乏可造成身材矮小、增加心血管疾病的风险、降低肌肉和骨密度等。

[0004] 为治疗生长激素缺乏，源自人脑下垂体或通过遗传工程技术生产的生长激素自20世纪50年代起被使用，全球人生长激素市场在2009年已达到约3万亿韩元。

然而，上述生长激素存在缺点，因为它们必须通过每天皮下注射给药，因而存在改善和增加患者依从度的需求。

为满足此需求，开发了长效人生长激素，并且为改善其长效性能，使用了缓释制剂和诸如与蛋白质或糖类融合、糖基化技术等的改造。

例如，2007年，Genetech公司
(Genentech Inc.)推出了作为第一种缓释人生长激素产品的Nutropin LG生命科
学公司(LG Life Sciences LTD.)(韩国)推出了Declage(韩国专利号10-0236771和10-0329336)。

然而，缓释治疗仍有问题，因为它们在体内引起不希望的免疫应答、由于使用相当厚的注射器针导致疼痛并具有低产量。

特别地，由于与其他第一代产品相比的低效
力，Nutropin退出了市场。

[0005] 为改善除了缓释制剂之外的蛋白的持续活性，可使用诸如与聚乙二醇融合成聚合物糖(Sada等人，发酵生物工程杂志71,137-139,1991)(Sada et al.,J.Ferment Bioeng 71,137-139,1991)、糖基化改造(美国专利号7,217,689)和与其他蛋白质融合(WO 93/15199)的方法以促进体内吸收、代谢和排出。

然而，上述方法未被用作常规的增加半衰期的方法，这是由于各种原因，包括由于低产量的低成本效益、长期使用中引起免疫应答、缀合中使用的化学物质的毒性等。

因此，存在用改善其长效性能同时最小化上述问题的方法开发长效人生长激素的需求。

韩国专利号10-1183262公开了以作为体内蛋白的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突变体和人生长激素之间的缀合物的形式开发长效人生长激素蛋白，尝试通过蛋白尺寸增加改善半衰期。

此外，韩国专利申请公开号10-2013-0029713公开了通过α-1抗胰蛋白酶上至少一个突变加入N-糖基，尝试增加体内半衰期的方法。

[0006] 本发明人使用的α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突变体是其中特定氨基酸被突变以移除α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的固有体内活性，同时增加其半衰期的突变体。

其作为蛋白酶抑制剂的固有活性被移除的α-1抗胰蛋白酶的蛋白质序列及其制备方法在韩国专利申请公开号10-2010-01165中公开。

[0007] 长效人生长激素是融合蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的突变体通过遗传重组与人生长激素的N端或C端融合，是与第一代人生长激素相比具有改善的半衰期的材料。

该长效人生长激素被制备，使得它在CHO细胞中表达以被糖基化，而大部分第一代人生长激素药物是在大肠杆菌(E.coli)中生产的。

[0008] α-1抗胰蛋白酶的纯化是通过用聚乙二醇和pH(EP专利号0097274)以及阳离子交换树脂(EP专利号96929430和95112630)将杂质选择性沉淀而常规进行的。

此外，第一代人生长激素通常是通过在大肠杆菌中以包涵体的形式过表达，然后重折叠并用阴离子交换树脂纯化制备的(韩国专利1998-0003752和Patra AK,Mukhopadhyay R,Mukhija R,Krishnan A,Garg LC,Panda AK.(2000)18,182-192,200；蛋白质实验纯化(Protein Expr.Purif.))。

[0009] 同时，该长效人生长激素NexP-hGH是一种具有约70至90kDa的分子量的新材料，它与第一代人生长激素或α-1抗胰蛋白酶在生理化学性质方面例如分子量、等电点、多糖模式等不同，具有高纯度的长效人生长激素不能由与用于第一代人生长激素或α-1抗胰蛋白酶的相同/相似的纯化方法获得。

此外，该长效人生长激素的纯化方法在专利或科学文献中未被公开。

[0010] 在此情况下，在致力于发现其高纯度尚未被认为可能的长效人生长激素的有效纯化方法时，本发明人发现高纯度长效人生长激素可通过阴离子交换树脂、疏水树脂、附着抗体片段的树脂等获得。

[0011] 此外，体内存在的蛋白的糖基化水平对半衰期和效力的影响程度多种多样，这取决于蛋白的类型，例如常规使用的蛋白药物促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子(GCSF)。

促红细胞生成素——一种存在于体内的蛋白——的体内效力取决于其唾液酸含量而改变(JCEgrie和JK Browne，英国癌症杂志(British J.of Cancer)，84,3-10,2001)。

具体地，促红细胞生成素在唾液酸含量和体内效力之间具有高度相关性，含有预定比例或更高的唾液酸含量的高度糖基化的多糖显示适当的效力。

相反，取决于多糖的存在/不存在，GCSF的效力在体外效力方面显示了高达25％的差异，但在体内效力方面没有差异(H Bonig等人.骨髓移植(Bone marrow transplantation)，28,259-264,2001)。

[0012] 因此，在致力于开发在体外和体内条件下都显示长效药物学活性，同时具有较低的免疫原性风险的人生长激素时，本发明人发现具有特定pI的NexP-hGH蛋白的一个同种型在上述在动物细胞中产生的蛋白中具有卓越的体内长效效果和生长效果，因而完成了本发明。

发明内容
[0013] 技术问题
[0014] 因此，本发明是在考虑了现有技术中发生的上述问题后作出的。

本发明的一个目的是提供一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶
突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更小的等电点(pI)。

[0015] 本发明的另一个目的是提供制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，该方法包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及(b)根据等电点(pI)差异，分离具有5.2或更低的等电点(pI)的长效生长激素NexP-hGH蛋白。

[0016] 本发明的进一步的目的是提供一种纯化高纯度长效人生长激素NexP-hGH的方法。

[0017] 技术方案
[0018] 为实现上述目的，一方面，本发明提供一种在动物细胞中产生的长效人生长激素NexP-hGH蛋白，其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合，具有5.2或更小的等电点(pI)。

[0019] 另一方面，本发明提供一种纯化长效人生长激素NexP-hGH的方法，所述方法包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中人生长激素与α-1抗胰蛋白酶突变体融合——的生物流体施加到阴离子交换树脂色谱；(b)将该包含NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)中产生的洗脱物施加到疏水树脂色谱；和(c)将该包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体或步骤(a)或步骤(b)中产生的洗脱物施加到填充了附着抗-α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。

[0020] 如本文所用，术语“人生长激素(hGH)”指允许人中生长、细胞增殖或再生的肽激素。

人生长激素可包括任何可刺激生长板中体内细胞分化，以促进生长的蛋白，而不限于本发明。

人生长激素包含天然产生的生长激素和通过遗传改造技术生产的，但不限于此。

此外，关于人生长激素的信息可从公众可获得的数据库，例如由美国健康研究院(National Institute of Health(NIH))国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)提供的GenBank获得，例如登录号为AAA98618的人生长激素等，但不限于此。

[0021] 由于人生长激素能在体内通过刺激骺板的细胞分化促进生长，它被视为重要的治疗蛋白以用于体内合成或分泌有困难的对象中。

然而，从对患者用药方便和治疗效果方面一直有开发具有与常规生长激素相比增加的半衰期的长效人生长激素的需求。

因此，本发明人开发了一种α-1抗胰蛋白酶突变体，与人生长激素融合，将获得的结果在动物细胞中表达，从而开发高度糖基化的人生长激素NexP-hGH。

该高度糖基化的人生长激素NexP-hGH 是动物细胞中产生的蛋白，具有5.2或更小的等电点(pI)。

它比pI超过5.2时具有更高程度的糖基化，从而实现高长效性能和效力。

[0022] 如本文所用，术语“长效人生长激素”指一种蛋白，其中人生长激素(hGH)和α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)融合，可与术语“NexP-hGH”互换使用。

NexP是本发明人命名的术语，指α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的一个突变体，是一种体内蛋白，通过保留体内长效性能具有增长的半衰期，由本发明人开发。

移除了其蛋白酶抑制剂活性的α-1抗胰蛋白酶的蛋白序列及其制备方法等在韩国专利号10-1183262和韩国专利申请号10-2013-0029713中公开，韩国专利号10-1183262或韩国专利申请号10-2013-0029713的全部内容作为引文使用，但不限于此。

[0023] α-1抗胰蛋白酶是一种存在于哺乳动物血液中的蛋白，具有约50000 Da的分子量，也称为α-1蛋白酶抑制剂。

从血液中提取的α-1抗胰蛋白酶被FDA批准，已经以的名称作为治疗肺气肿的治疗剂上市。

通常以60mg/kg的剂量通过静脉内注射以一周的间隔给药，是一种其临床安全性已被确认的蛋白。

此外，α-1抗胰蛋白酶作为蛋白酶抑制剂的功能和结构众所周知(Elliott,P.等人，JMB 275,419-425,1998)。

此外，α-1抗胰蛋白酶以超过100种不同的等位基因存在，其表型根据其等电聚焦(IEF)类型分类为‘A’至‘Z’(Stoller等人，The Lancet，365,2225-2236,2005)。

其中，最普遍的M型等位基因是正常型，又基于氨基酸序列的突变分类为亚型例如M1(Val 213)、M2和M3。

因此，用于本发明的α-1抗胰蛋白酶是一种天然存在的特定亚型，可对其它亚型具有相同效果。

关于α-1抗胰蛋白酶的信息可从公众可获得的数据库例如由美国健康研究院(NIH)的国立生物技术信息中心(NCBI)提供的Genbank获得，例如登录号为AAH11991的野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白等，但不限于此。

野生型α-1抗胰蛋白酶蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示。

[0024] α-1抗胰蛋白酶可通过经由位点定向诱变修饰至少一个其氨基酸残基移除其体内固有活性，从而增加其半衰期。

通过上述氨基酸残基(一个或多个)的修饰，产生α-1抗胰蛋白酶的N-糖基化区域，从而通过氨基酸替换最小化在注射入体内时的免疫原性，同时中和α-1抗胰蛋白酶的蛋白酶抑制剂活性，并可防止游离半胱氨酸形成二聚体。

具体地，至少一个氨基酸中的突变的特征可在于SEQ ID NO:1所表示的α-1抗胰蛋白酶的第357个氨基酸脯氨酸(P)上的突变，该脯氨酸是该α-1抗胰蛋白酶中的P2位，更具体地，是脯氨酸至天冬酰胺(N)的转变。

此外，该α-1抗胰蛋白酶突变体可包含SEQ ID NO:1所表示的α-1抗胰蛋白酶的第9个氨基酸谷氨酰胺(Q)上突变为天冬酰胺(N)；第232个氨基酸半胱氨酸(C)上突变为丝氨酸(S)；或第359个氨基酸丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)等的突变，该突变体也可包含至少一个上述突变，以及第357个氨基酸脯氨酸(P)即P2位上突变为天冬酰胺(N)的突变，但不限于此。

[0025] 该长效人生长激素NexP-hGH是一种蛋白质，其中任何上述α-1抗胰蛋白酶(A1AT)突变体通过遗传重组与人生长激素的N端或C端融合。

具体地，该长效人生长激素NexP-hGH可以是一种融合蛋白(hGH-A1AT(Q9N，P357N))，其中该α-1抗胰蛋白酶突变体——其中第9个氨基酸谷氨酰胺和第357个氨基酸脯氨酸都突变为天冬酰胺——与人生长激素的N端融合，但不限于此。

[0026] 如本文所用，术语“高度糖基化的长效人生长激素”指一种包含α-1抗胰蛋白酶突变体和人生长激素的形式的长效人生长激素，它与天然状态下存在的野生型蛋白相比具有较高程度的糖基化，并具有5.2或更低的等电点。

[0027] 在本发明中，确认了长效活性随着该长效人生长激素的糖基化程度变高而变高。

具体地，确认了当该长效人生长激素的等电点为5.2或更小时，体内的长效活性和药物活性在体外和体内都极高。

[0028] 该高度糖基化的长效人生长激素具有5.2或更低的等电点，优选地在3.5至5.2的范围内，但不限于此。

[0029] 具体地，糖基化的区域是多肽内的氨基酸残基或区域，其中可发生糖基化例如碳水化合物结构的附着，例如N-糖基化的区域或O-糖基化的区域。

保守的N-糖基化区域可
以是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是任何氨基酸，但不限于此。

[0030] 该高度糖基化的长效人生长激素可通过培养引入包含编码该长效人生长激素的多核苷酸的表达载体的动物细胞产生。

[0031] 如本文所用，术语“动物细胞”指能表达本发明的长效人生长激素的细胞，只要它们能引起糖基化，可不具体限制，例如CHO细胞、BHK细胞、Vero细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、293细胞和3T3细胞，但不限于此。

[0032] 在本发明的一个实施方式中，制备了与其中第9个氨基酸谷氨酰胺和第357个氨基酸脯氨酸都用天冬酰胺取代的α-1抗胰蛋白酶突变体融合的人生长激素蛋白，包含编码上述蛋白的多核苷酸的载体被引入CHO细胞，从而构建一个稳定细胞系(实施例1)。

此外，在依次进行阴离子交换树脂色谱、疏水色谱和其中用附着了抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂填充用于亲合色谱的柱的亲合色谱后，根据等电点的差异获得NexP-hGH蛋白。

确定了在同种型1-3中具有最低的pI的同种型1具有比同种型2和同种型3高的糖基化程度，而具有比同种型3低的pI的同种型2具有比同种型3高的糖基化程度(图1和图2)。

此外，从药物动力学角度确定了随着糖基化程度的增加，本发明的长效人生长激素具有优秀的药物动力学性质，并且具体地，等于或超出阳性对照组(图3)。

此外，确定了与阳性对照组中的实验动物相比，同种型2和同种型3显著增加了实验动物的体长。

即，本发明的高度糖基化的长效人生长激素显示与阳性对照组相比显著高的有效性。

[0033] 在本发明的另一方面，提供了制备长效人生长激素NexP-hGH蛋白的方法，包括：(a)将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白——其中α-1抗胰蛋白酶突变体(NexP)与人生长激素(hGH)融合——的生物流体施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱；以及(b)根据等电点(pI)差异，分离具有5.2或更低的等电点(pI)的长效生长激素NexP-hGH蛋白。

[0034] 该α-1抗胰蛋白酶突变体、人生长激素和该长效人生长激素与上文所解释的相同。

[0035] 上述制备方法的每个步骤可详细说明如下。

[0036] 首先，步骤(a)涉及将包含长效人生长激素NexP-hGH蛋白的生物流体施加到填充了附着抗α-1抗胰蛋白酶抗体片段的树脂的亲合色谱柱。

[0037] 上述步骤是通过NexP和抗体片段之间的亲和性将NexP-hGH附着到柱的步骤。

[0038] 如本文所用，术语“包含长效人生长激素NexP-hGH的生物流体”可指生产长效人生长激素NexP-hGH蛋白的细胞的细胞培养物上清、其细胞提取物或其部分纯化形式，但不限于此。

具体地，该生物流体优选地是通过培养引入包含编码该长效人生长激素的多核苷酸的表达载体的动物细胞获得的细胞的细胞培养物上清或细胞培养物提取物，或其细胞提取物，但不限于此。

[0039] 如本文所用，术语“部分纯化”指在进行至少一个纯化过程例如色谱后，显示除了具有意欲的pI值的蛋白外其他蛋白也存在的状态。

上述部分纯化过程不具体限制其类型，但可以是例如疏水色谱或阴离子交换树脂色谱，但不限于此。

该部分纯化可用至少一种选自疏水色谱和阴离子交换树脂色谱的方法进行，优选地，通过将产生长效人生长激素NexP-hGH蛋白的细胞的细胞培养物上清或其细胞提取物施加到阴离子交换树脂色谱或疏水树脂色谱，从而从其产生洗脱物，并且更优选地，依次实施阴离子交换树脂色谱和疏水树。