龙眼胚性愈伤组织微管蛋白基因β-tubulin克隆及序列分析

龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS的克隆与表达分析张冬敏;田奇琳;杨曼曼;林玉玲;赖钟雄【摘要】以龙眼‘红核子’LCc悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织为基本材料,按照龙眼体细胞胚胎同步化方法诱导获得龙眼体胚不同阶段材料,并以龙眼体细胞胚胎发生不同阶段混合材料作为试验材料,采用RT PCR结合RACE技术分离并克隆龙眼中编码同源异型结构域蛋白的转录因子WUSCHEL(简称DlWUS)的cDNA全长及DNA序列,并进行序列分析与表达分析.结果表明:DlWUS的cDNA全长1 110 bp,开放阅读框(ORF)858 bp,共编码285个氨基酸(GenBank登录号为KM017506),DlWUS的DNA包含2个内含子.序列分析表明,DlWUS是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,亚细胞定位于细胞核,具跨膜结构和Homeodomain超级家族的保守结构域以及WUS转录因子家族特有的WUS box和EAR-like结构域,推测该目的基因确实为WUS转录因子.系统进化分析显示,龙眼DlWUS与脐橙WUS归为一个分支,亲缘关系较近.实时荧光定量PCR分析结果表明,在龙眼体细胞胚胎发生整个过程中,DlWUS均有表达,但仅在球形胚时期表达量较高,说明DlWUS 可能主要在球形胚阶段发挥作用,并且在一定浓度范围内,外源施加IAA和GA3能够促进DlWUS基因的表达,而外源施加SA则抑制DlWUS基因的表达.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2015(035)005【总页数】8页(P890-897)【关键词】龙眼;体细胞胚胎发生;WUSCHEL;实时荧光定量PCR【作者】张冬敏;田奇琳;杨曼曼;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q789体细胞胚胎发生是植物体外再生的一种有效方法,目前已经有许多经济作物利用体细胞胚胎发生来获得体外再生植株,并且因为体细胞胚胎发生的生长发育过程类似于合子胚,所以也常常作为研究高等植物合子胚生长发育的模式材料。

龙眼胚性愈伤组织中TFL1基因克隆及其表达分析佚名【摘要】TFL1 is belonging to the FT/TFL1 family, and it is involved in delaying the plant flowering time through maintaining the apical meristem. The RT-PCR combined with RACE method was used to obtain the complete cDNA and gDNA sequences of DlTFL1 from embryogenic callusin Dimocarpus longan. The complete cDNA sequence of DlTFL1 was 866 bp, encoding 175 amino acids. The gDNA sequence of DlTFL1 was 1 492 bp, contains three introns and for exons. DlTFL1 was stable and hydrophilic proteins, without signal peptides and Tran membrane structures, had the PEBP protein function domain. Phylogenetic tree analyses indicated that DlTFL1 has a close genetic relationship with Jatropha curca、Vitis vinifera、Populus trichocarpa. qPCR result indicated that the expressing of DlTFL1 was very differential in“Sijimi” different tissues, it expressed at the highest level in the flower bud, lower in root, leaf and flower, but not expressing in other tissues. DlTFL1 is a plant TFL1 homologous gene, may have inhibitory effect on flowering, it may promote the development of early flowers of“Sijimi”longan.%TFL1是FT/TFL1家族的一个成员，TFL1通过对顶端分生组织的维持从而延迟了植物开花时间。

福建农业大学学报30(1):29-32,2001Journal of F ujian A g ricultural U niv ersit y文章编号:1006-7817-(2001)01-0029-04龙眼胚性愈伤组织长期继代培养及其染色体数目变异赖钟雄,陈春玲,黄素华,桑庆亮,潘东明,陈振光(福建农林大学园艺系,福建福州350002)摘要:从龙眼幼胚培养诱导并筛选出的松散型胚性愈伤组织,在继代培养基上已培养6a以上,所保持的若干愈伤组织仍具有强烈的体细胞胚胎发生能力.经细胞学检查,其中个别愈伤组织系的部分愈伤组织团发现有2n=3x=45,或2n=4x=60等染色体数目的变异细胞,这对于离体筛选龙眼细胞突变体很有价值.关键词:龙眼;胚性合作愈伤组织;长期继代;染色体数目变异中图分类号:S667 文献标识码:ALong-term subculture of embryogenic calli and their genetic variation of the chromosome number in longanLAI Zhong-x io ng,CHEN Chun-ling,HU ANG Su-hua,SANG Qing-liang,PAN Dong-ming,CHEN Zhen-g uang(D epar tment o f Ho rt icultur e,F ujian A gr icult ur e and F or estr y U niv ersit y,Fuzho u,F ujian350002,China)Abstract:Fr iable embr yo genic calli induced and then selected fr om t he cult ur e of longan(Dimocarp us longan L our.)immatur e embr yo s maintained st ro ng capacity o f so matic embr yo g enesis after having been subcultur ed for o ver6y ea rs.T he cy to lo gical ex aminatio ns show ed t ha t there w ere some cell var iat ions w ith the chr omo-so me number2n=3X=45,or2n=4X=60or o thers in some cell cluster s o f callus lines,which w as o f gr eat value for obtaining cell v ariant s in vitro in long an.Key words:lo ngan;em br yo gnic callus;long-ter m subcult ur e;v ar iatio n of chro moso me number龙眼(Dimocarp us longan Lo ur.)是我国南方著名的一种热带木本果树.由于常规育种工作有很大局限性,近年来龙眼生物技术研究日益受到重视,有关科研工作者进行了大量研究,试图为龙眼品种改良开辟新途径[1,2].愈伤组织的长期继代保持是植物生物技术的重要基础性工作.因愈伤组织不能长期继代保持,制约了许多植物生物技术的发展.在果树上,这个问题尤为突出.近20a来林顺权等[3,5]和陈振光[4]在枇杷的胚乳培养、原生质体培养等方面做了大量的研究.但由于愈伤组织易褐化死亡而不能长期保持,影响了进一步的研究与应用,严重制约了枇杷生物技术的发展[6].鉴于此,我们在原有工作[7]的基础上,进一步进行了龙眼胚性愈伤组织的长期继代保持的研究;同时,我们还初步检查了龙眼胚性愈伤组织的染色体数目变异情况,以期为龙眼离体体细胞突变体筛选提供科学依据.收稿日期:2001-01-10基金项目:国家教育部首批高等学校骨干教师资助计划、国家自然科学基金(39870544)、福建省自然科学基金(B0010014, F99003)、霍英东教育基金会高等学校青年教师基金(71026)、国家“948”计划(991029)以及福建省科委(98-Z-3)等资助项目的部分内容.作者简介:赖钟雄(1966-),副研究员,博士.研究方向:园艺植物生物技术与种质资源.1　材料与方法1.1　植物材料由红核子幼胚培养诱导并筛选松散型(C 型)胚性愈伤组织系,建立于1994年,方法见文献[7].1.2　试验方法1.2.1　龙眼胚性愈伤组织的继代培养　参照前文[8]中龙眼胚性愈伤组织继代保持的方法.在继代中,随机选取10团C 型胚性愈伤组织分开继代保持,形成10个胚性愈伤组织无性系(Em br yog enic callus clone,ECL).经过数代继代、观察后,淘汰颗粒变粗、生长势下降的ECL.相似的材料不再重复保存.取长势良好的2个ECL 长期保持.这两个ECL 分别定名为LC 1和LC 2.采用赖钟雄[7]的方法测定ECL 的体细胞胚胎发生能力,分离原生质体以及建立悬浮细胞系试验.1.2.2　龙眼胚性愈伤组织的染色体数目检测　随机对LC2龙眼胚性愈伤组织系的不同愈伤组织团进行染色体数目检查.具体方法为:取继代培养后10-15d 、正在旺盛生长的龙眼胚性愈伤组织,直接投入酒精(体积分数为0.95)-浓HCl (1∶1)(体积比)解离液解离25-35min ,然后用蒸馏水浸洗20-30min,当中换水3-4次.洗去HCl 后,愈伤组织用丙酸-铁钒-苏木精染色液染色,常规压片法制片,凡士林临时封片[9].制片后在Olym pus HB 显微镜下观察染色体数目,计数并对典型分裂相进行显微摄影.2　结果与分析2.1　龙眼胚性愈伤组织的长期继代保持作者于1994年诱导并筛选出的龙眼松散型胚性愈伤组织[7],严格按照前文[8]所采用的交替培养方法,至今已保持6a 以上,大大超过我们曾报道过的保持2a 的年限[8].而且,经筛选的ECL 形态不变,经测定仍保持原有的强烈体细胞胚胎发生能力与生长势,并能用于原生质体分离和悬浮细胞系的建立,表明可以继续长期保持.在本研究中,采用了含1m g ・L -12,4-D 与含1mg ・L -12,4-D 、0.5m g ・L -1KT 、5mg ・L -1Ag NO 3的2种M S 培养基交替继代培养.M S 培养基中的Co 2+与附加的A gNO 3分别是乙烯形成酶抑制剂和乙烯作用部位竞争性抑制剂,能够抑制乙烯的作用或拮抗乙烯的作用.乙烯的主要生理作用是促进衰老.在愈伤组织保持过程中,封闭的培养容器中乙烯的积累对培养物的保持产生的作用是不可忽视的.从本试验看,Co ++与AgNO 3的存在抑制了乙烯的形成或抑制其生理效应,促进了龙眼胚性愈伤组织的正常生长;同时,AgN O 3还可维持胚性愈伤组织状态,防止胚性愈伤组织因体胚发育而丧失[8].因此,在龙眼胚性愈伤组织长期继代保持中,交替继代培养的程序以及Co 2+与AgNO 3的存在起了关键作用.在继代过程中,继代材料的选择十分重要.应选择淡黄色、颗粒细小、生长旺盛的愈伤组织来继代保持.此外,及时继代也很重要,一般继代周期控制在20-25d.2.2　长期继代的龙眼胚性愈伤组织的染色体数目的变化随机对LC 2龙眼胚性愈伤组织系的不同愈伤组织团进行染色体数目检查.结果表明,将未经有丝分裂阻抑剂预处理及固定处理的龙眼胚性愈伤组织直接投入解离液[酒精(体积分数为0.95)-浓HCl(1∶1)]解离、染色的方法,是一种快速检查染色体数目的简便方法.制片后・30・福建农林大学学报　2001年第30卷观察到的分裂相分色、染色体染色效果都不错.整个过程只需1-1.5h .对于正在旺盛生长的胚性愈伤组织进行随机取样观察,发现有丝分裂指数一般在1%-2%以上.这种方法特别适宜于染色体较小的植物种类的染色体数目的快速检测.对随机取样的不同龙眼胚性愈伤组织团的染色体数目的观察表明,绝大多数的胚性愈伤组织团细胞染色体数目正常(2n =2x =30);个别细胞团的部分细胞出现染色体数目为2n =31-60的情况;以2n =3x =45以及2n =4x =60居多(图1).在离体培养物中,染色体数目异常是一个普遍现象.染色体丢失或多倍化是最常见的情况.在本研究中,发现有三倍体的细胞出现,而且在染色体异常细胞中所占比例较大,其形成机理可能较为复杂.这在以往鲜有报道.根据我们掌握的资料,目前仅在小麦有过报道.关于这些染色体畸变规律以及染色体畸变细胞突变体筛选的详细研究工作正在进一步进行.A.2n =3x =45;B .2n =4x =60.图1　龙眼胚性愈伤组织染色体数目变异Fig .1　Th e gen etic variation of the ch romosome n umber in lon gan em bryogen ic calli龙眼胚性愈伤组织的染色体数目检测结果表明,本研究中继代培养基较适宜于龙眼正常细胞生长,遗传稳定性较好.只要选取适宜材料和采取适宜的程序继代,可基本保持愈伤组织状态正常.3　讨论3.1　龙眼胚性愈伤组织长期继代培养技术建立的意义龙眼胚性愈伤组织长期继代培养技术的建立,对龙眼生物技术和基础理论研究有重要价值.首先,可为龙眼的各种生物技术研究源源不断地提供胚性愈伤组织材料,如建立悬浮细胞系、分离原生质体和微原生质体以及进行遗传转化等.其次,龙眼体细胞胚胎发生能力很强,可作为研究木本植物体细胞胚胎发生的模式系统[1,2,10-13].而胚性愈伤组织能长期继代保持是建立龙眼体细胞胚胎发生实验系统的前提条件.第三,可作为研究离体培养物的形态发生保持机理研究的一个良好实验系统.第四,龙眼胚性愈伤组织不易褐变的现象,可作为研究离体培养物褐变现象的一个对比系统.通过比较枇杷与龙眼胚性愈伤组织生理状态上的差异,这种长期继代培养技术可能为枇杷胚性愈伤组织解决诸如无法长期保持、易褐变死亡等问题提供参・31・第1期 赖钟雄等:龙眼胚性愈伤组织长期继代培养及其染色体数目变异考[5,6].3.2　龙眼离体细胞突变体筛选的潜力自然界的龙眼皆为二倍体.筛选出人工非整倍体或多倍体材料,对于丰富龙眼种质资源、育种以及基因定位和功能研究等方面有重要价值.本研究中发现龙眼离体培养细胞染色体数目有较大的变异范围,表明其细胞突变体筛选潜力很大.如果结合人工诱变,效果可能更好.但是,由于目前变异细胞仅是少量出现,而且其遗传稳定性以及从细胞传递到个体的能力尚不明了,龙眼离体细胞染色体变异突变体的筛选仍有大量的工作要做.参考文献:[1]L AI Z X,CHEN C L ,ZEN G L H,et al.Soma tic embry og enesis in lo ngan (Dimocarp us long an Lo ur.)[A ].JA IN J M et al .Somatic Embryogensis in Woody Plants (V ol .6)[M ].Dor dr echt :Kluwer A cad .Publisher s ,2000.415-432.[2]L A I Z X,CHEN C L ,CHEN Z G.Pr og ress in bio techno log y in lo ngan[A ].Int Soc o f Hor t Sci.Ab -stract of 1st Int .Symp .on lithici &longan [M ].G uang zhou:Int So c of Hor t.Sci.2000,30.[3]林顺权.枇杷胚乳培养获得植株研究[J ].福建农学院学报.1985,14(2):117-125.[4]陈振光,林顺权,林庆良.枇杷胚乳培养再生植株试验初报[J ].福建农学院学报,1983,12(4):343-346.[5]林顺权,陈振光.枇杷原生质体培养再生植株[J].园艺学报.1995,22(6):1-5.[6]王家福,刘月学,宋刚,等.枇杷胚性愈伤组织的诱导和保存[J].福建农业大学学报.2000,29(3):305-310.[7]赖钟雄.龙眼原生质体培养再生系统的研究[D].福建农业大学,1997.2-90.[8]赖钟雄,潘良镇,陈振光.龙眼胚性细胞系的建立与保持[J].福建农业大学学报,1997,26(2):160-167.[9]李懋学,张赞平.作物染色体及其研究技术[M ].北京:中国农业出版社,1997.23-39.[10]L AI Z X ,CHEN Z G ,HE B Z .So matic embry og enesis in lo ngan [A ].L AR KI N P J .Proceedings of the4th Asia -Pacif ic Conference on Agricultural Biotechnology [M ].Canberr a:U T C P ublishing ,1998.369-371.[11]赖钟雄,陈振光.龙眼胚性愈伤组织的高频率体细胞胚胎发生[J ].福建农业大学学报,1997,(3):271-276.[12]赖钟雄,陈振光.龙眼体细胞胚胎高频率萌发与植株再生[J].福建农业大学学报,1998,(1):31-36.[13]赖钟雄,潘良镇,陈振光,等.无患子科果树生物技术研究现状与展望[J].中国南方果树,1997,(6):37-39.・32・福建农林大学学报　2001年第30卷。

龙眼胚性愈伤组织DRM1基因的r克隆及其定位与表达分析白玉;陈晓慧;谢礼洋;吴晓佩;林玉玲;赖钟雄【摘要】该研究以龙眼胚性愈伤组织的转录组数据为基础,对龙眼胚性愈伤组织DlDRM1基因进行克隆和生物学信息分析,并检测其在体胚发生过程中不同发育阶段、不同浓度的外源激素(2,4-D、IAA、KT)处理下及不同组织部位的表达,以揭示DlDRM1基因在龙眼体胚发生过程中的功能.结果表明:(1)从龙眼转录组unigene 序列筛选获得龙眼结构域重排甲基化酶1基因(命名为DlDRM1)全长序列,并利用RT-PCR法从'红核子'龙眼胚性愈伤组织中克隆获得DlDRM1基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为KY990493);DlDRM1基因cDNA全长2574 bp,包括494 bp的5′U T R,184 bp的3′U T R,可编码包含631个氨基酸的蛋白质.(2)生物信息学分析显示,DlDRM1是一个不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,不存在跨膜结构域,其分子式为C3104 H4839 N851 O984 S28;序列比对和系统进化分析表明,龙眼DlDRM1与脐橙DRM相似度最高(76.85%),二者亲缘关系也最为接近.(3)实时荧光定量PCR分析发现,DlDRM1在龙眼各组织器官中均有表达,且在果肉中表达量最高,其次是花蕾,在叶中的表达量最低;DlDRM1基因在非胚性愈伤组织中表达量最高,而且在非胚性愈伤向胚性愈伤转变过程中DlDRM1基因的表达量呈逐步下降趋势,说明DlDRM1基因与体胚胚性呈负相关关系,在龙眼体胚发生过程中可能发挥着重要的作用;一定浓度的IAA和2,4-D能够促进DlDRM1基因的表达,而KT则抑制DlDRM1的表达.(4)亚细胞定位结果表明,DlDRM 1定位于细胞核和细胞膜上.%Based on the transcriptome data of longan embryogenic callus ,we cloned the Dimocarpus longan DRM1 gene.The functions of DlDRM1 was analyzed by means of bioinformatics and real-time quantitativePCR .Expression of DlDRM1 was analyzed in the stages of somaticembryogenesis ,exogenous hormone (2 ,4-D ,IAA ,KT) treatment and different tissues in D .longan .The purpose is to reveal the D .longan DRM1 gene function in the process of longan somatic embryos .The results showed that :(1) the full-length sequence of longan's Domains Rearranged Methyltrans f erase 1 gene (DlDRM1) was successfully cloned from embryogenic callus of 'Honghezi' longan by using RT-PCR (GenBank accession number is KY990493) based on the transcriptome data of longan embryogenic callus unigene sequences .The cDNA full-length is 2574bp ,including 494 bp 5′UTR and 184 bp 3′UTR ,and it could encodes protein with 631 amino acids .(2) Bioinformatics analysis showed that DlDRM 1 (molecular formula :C3104 H4839 N851 O984 S28 ) was an unstable hydrophile protein ,without signal peptide and transmembrane domain .Sequence align-ment result showed DlDRM1 was highly similar to DRM in navel orange (up to 76 .85% ) ,and the closest genetic relationship was also found between the two proteins according to phylogenetic analysis .(3) Quan-titative real-time PCR showed that DlDRM1 expresses in all of the tissues and organs in longan and the highest expression was found in flesh ,followed by flower buds ,and the lowest expression was found in leaves .Notably ,the expression of DlDRM1 in non-embryonic callus was found to be significantly higher than that in embryoniccallus ,and its expression decreases during the process of the non embryonic callus changes to be embryonic .These indicated that DlDRM1 was negatively correlated with the embryonic of somatic embryo and it might contribute to the longan somatic embryogenesis .Moreover ,we alsostudied the effects of hormones on the expression of DIDRM1 .And it was found that certain concentrations of IAA and 2 ,4-D could promote its expression ,while KT inhibit its expression .(4) Subcellular localization result showed that DlDRM 1 was located in nucleus and cell membrane .【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2017(037)011【总页数】9页(P2097-2105)【关键词】龙眼;体胚发生;DlDRM1;基因克隆;表达分析【作者】白玉;陈晓慧;谢礼洋;吴晓佩;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786表观遗传是指基因的表达在有丝分裂或减数分裂过程中，发生了可遗传的变化，而序列不发生改变的遗传[1]。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811105553.8(22)申请日 2018.09.21(71)申请人 南京农业大学地址 210095 江苏省南京市卫岗1号(72)发明人 周明国　宋修仕　谷凯鑫　侯毅平　段亚冰　王建新　(74)专利代理机构 北京君智知识产权代理事务所(普通合伙) 11305代理人 黄绿雯(51)Int.Cl.C07K 14/37(2006.01)C12N 15/31(2006.01)C12N 15/82(2006.01)A01H 5/00(2018.01)(54)发明名称β-微管蛋白、其所述基因β-tubulin及其基因区段的应用(57)摘要本发明提供β-微管蛋白基因β-tubulin区段，还提供所述区段在防治植物病害和/或增强植物的抗病性、在抑制病原真菌发育和致病力、以及在提高病原真菌对微管蛋白结合剂的药敏性中的应用。

本发明还提供一种体外干扰制剂，所述体外干扰制剂含有上述βtubulin基因βTubdsRNA区段，以及所述体外干扰制剂在转基因植物抗病品种培育中的应用。

本发明的微管蛋白β-tubulin基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性；防治多种植物病害；提高对化学药剂多菌灵的药敏性，同时多菌灵可延长dsRNAs药剂的持效期等绿色、安全的突出优点。

权利要求书1页 说明书13页序列表7页 附图6页CN 109265526 A 2019.01.25C N 109265526A1.β-微管蛋白基因β-tubulin区段，其特征在于所述区段是以βTubdsRNA区段、dsRNA区段的联合或以全长或部分βTubdsRNA进行RNase消化后随机产生15-30nt的siRNA。

2.根据权利要求1所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段，其特征在于所述β-微管蛋白基因来源于亚洲镰刀菌(ticum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)、三线镰刀菌(F.tricinctum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)或炭疽(Colletotrichum higginsianum)。

龙眼胚性愈伤组织微管蛋白基因β-tubulin克隆及序列分析王亚婷;林玉玲;曾丽兰;赖钟雄【摘要】以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,利用RT-PCR法首次克隆2条含有完整开放阅读框的β-tubulin基因的cDNA序列,命名为dl-β-tubulin3和dl-β-tubulin6长度分别为1350和1351 bp,均编码含有446个氨基酸残基的蛋白质.生物信息学分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域;与毛果杨、大豆、水稻、玉米和拟南芥具有较高的同源性;含有微管蛋白所特有的2个保守结构域NNWAKGH和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE,以及1个GTP结合位点GGGTGSG.推测β-tubulin通过不同的磷酸化方式改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚发生过程的调控.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(043)001【总页数】6页(P49-54)【关键词】龙眼;胚性愈伤组织;微管蛋白基因;克隆;序列分析【作者】王亚婷;林玉玲;曾丽兰;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S667.2微管和微丝是植物细胞的主要结构［1］，微管在细胞形态维持、细胞有丝分裂、细胞内物质运输和细胞壁构建等真核生物重要生理活动过程中发挥着不可替代的作用［2－4］，它的排布方式在很大程度上决定了植物的生长发育和形态建成［5－6］.植物细胞微管的排布方式需要微管蛋白及微管结合蛋白的参与，这2种蛋白在蛋白质磷酸酶和激酶的控制下处于平衡状态.微管蛋白是微管的主要组成成分和基本单位，主要以α-微管蛋白和β-微管蛋白存在［7］.在大多数高等植物［8］和动物中［9］，微管蛋白由多基因家族编码.例如，在玉米中至少有8个α-微管蛋白基因［10］，在拟南芥中有6个α-微管蛋白基因和9个β-微管蛋白基因［6］;在哺乳动物中约有20个α-微管蛋白基因(α-tubulin)和β-微管蛋白基因(β-tubulin)，但它们中的很多成员是假基因［11－12］.随着分子生物学的发展及基因组测序的开展，从1963年Ledbetter和Porter［3］证实植物细胞中存在微管结构以来，已经克隆出大量微管蛋白基因［13－16］.在植物学领域，目前关于微管蛋白基因的克隆主要集中在拟南芥、水稻、玉米和毛果杨等植物，对龙眼体胚的研究几乎是空白，由于微管蛋白作用的重要性及不可替代性，微管蛋白基因的克隆及分析越来越成为研究的热点.龙眼(Dimocarpus Longan Lour.)属于无患子科龙眼属植物，是著名的热带亚热带水果之一.关于龙眼微管蛋白基因的研究，仅在花芽上有1例报道［17］，该研究主要集中在α-tubulin基因的克隆及其在翻译和转录水平上对龙眼成花逆转形成的调控.龙眼β-tubulin基因的克隆还未见报道.根据本实验室龙眼体胚转录组测序数据(NCBI:SRA050205)显示，龙眼β-微管蛋白基因存在2个成员，即β-tubulin3和β-tubulin6.这2个成员在胚性愈伤组织均有表达，但其表达量差异较大，表明其可能在龙眼体胚发生过程中发挥着重要的调控作用.因此，本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料，参照龙眼体胚转录组数据信息(NCBI:SRA050205)，采用RT-PCR 方法克隆β-tubulin基因的开放阅读框(open reading frame，ORF)，为进一步研究微管蛋白基因在龙眼体胚发生过程中的作用提供依据.1 材料与方法1.1 材料以福建农林大学园艺植物生物工程研究所保存的龙眼“红核子”品种胚性愈伤组织(LC2细胞系)作为试验材料［18］，用于总RNA的提取及后续试验.1.2 方法1.2.1 龙眼胚性愈伤组织总RNA提取及cDNA合成总RNA的提取参照TriPure 试剂盒(Invitrogen公司)说明书;cDNA第一链的合成采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Fermentas公司)，逆转录过程参照说明书.1.2.2 引物设计根据龙眼体胚转录组的信息，β-tubulin3已经获得全长，只需直接进行ORF验证;β-tubulin6获得5'序列.因此，检索 GenBank已登录的植物tubulin mRNA或cDNA序列，设计保守区扩增引物，进行PCR扩增.根据获得的保守区序列，设计3'RACE扩增引物.根据拼接的全长序列，设计ORF扩增引物，进行β-tubulin6的ORF扩增.引物设计、序列分析均采用DNAMAN软件.由于后续试验的需要，引物分别引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，引物合成均委托上海博尚生物公司完成(表1).表1 引物序列Table 1 Primers sequence引物序列F:β-tubulin6-P1 5'-ATGGATCCTTATGCGCGAAATTCTTC-3'R:β-tubulin6-P2 5'-ACACATCATATTCTTGGCATCCCAC-3'F:β-tubulin6-P3 5'-GATGAGTGCATGGTTCTTGACAATGAAG-3'F:β-tubulin6-P4 5'-GTGGGATGCCAAGAATATGATGTGTG-3'F:β-tubulin3-P5 5'-AAGGATCCTGGAGAAAATCAATCAAGCGA-3'R:β-tubulin3-P6 5'-ATATGTCGACTCTTCTTCAAGCCTCATC-3'R:β-tubulin6-P7 5'-TCCGGTCGACCTACATTTCATGCATATC-3'接头引物AUAP 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'表2 基因克隆的PCR反应条件Table 2 PCR assays condition in gene cloning 目的片段引物退火温度延伸时间℃s β-tubulin6保守区 P1、P2 53.9 60 β-tubulin6 3'RACE 第1 轮 P3、AUAP 56.0 30第2 轮 P4、AUAP 55.7 30 β-tubulin3 ORF P5、P6 56.0 60 β-tubulin6 ORF P1、P7 53.9 601.2.3 RT-PCR 扩增 PCR 反应体系为25 μL.其中，Dream Taq Green PCR Master Mix(Fermentas，加拿大)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游和下游引物均为1 μL，模板 cDNA 为1 μL.PCR 扩增程序(表2):94℃预变性2 min，94℃变性1 min，53－56℃退火45 s，72℃延伸30－60 s，35个循环，72℃ 10 min. 1.2.4 目的片段回收、克隆和测序目的片段回收采用DNA快速纯化回收试剂盒(TaKaRa，日本)，利用天根的DH5α感受态细胞.以pMD-18T(TaKaRa，日本)为载体对回收片段转化和克隆，挑选阳性克隆子委托上海博尚生物技术公司测序. 1.2.5 β-tubulin基因的生物信息学分析利用ExPASy ProtParam软件对β-tubulin基因编码的蛋白质基本理化性质进行分析;利用SignalP 3.0 Server和WoLF PSORT软件进行蛋白的信号肽及断裂位点和亚细胞定位情况分析;利用TMpred进行蛋白质跨膜结构的预测;利用NetPhos 2.0 Server进行磷酸化位点预测;利用ScanProsite在线分析工具进行蛋白质功能基序预测;利用InterProScan 预测蛋白质保守结构域;利用Protein Structure Prediction Server预测蛋白质二级结构;利用SWISS-MODEL预测蛋白质三维结构;利用Mega 5.0软件构建以氨基酸序列为基础的分子系统进化树，进化树中的数字代表bootstrap值，重复检验1000次.2 结果与分析2.1 β-tubulin3与β-tubulin6基因的克隆利用合成的保守区cDNA第1链为模板进行PCR扩增，扩增得到961 bp的β-tubulin6基因保守区cDNA片段(图1A)，利用合成3'RACE的cDNA第1链为模板进行巢式PCR扩增，扩增得到约750 bp的特异性条带(图1B);根据龙眼体胚转录组信息，利用合成的保守区cDNA第1链为模板进行PCR扩增，产物为β-tubulin3基因的ORF cDNA片段(1500 bp，图1C);通过比对和拼接得到β-tubulin6基因cDNA全长，以保守区cDNA为模板扩增得到1500 bp的特异性条带(图1D).图1 龙眼胚性愈伤组织β-tubulin扩增结果Fig.1 Results of agarosegel(1%)electrophoresis of β-tubulinA:保守区片段;B:3'端片段;C:β-tubulin3 ORF 序列;D:β-tubulin6 ORF 序列;M:DNA marker.测序结果显示β-tubulin6保守区片段长度为961 bp，3'端片段长度为619 bp，利用DNAMAN软件去除载体，则保守区913 bp，3'端607 bp.将这2个序列的核苷酸和氨基酸序列分别在GenBank上进行blast和blastp分析，均与数据库中已有的tubulin基因ORF的cDNA核苷酸和氨基酸序列高度同源，推断这2个片段为龙眼胚性愈伤组织tubulin基因的cDNA序列.2.2 β-tubulin3与β-tubulin6基因ORF序列将测序得到的β-tubulin3基因序列去除载体，获得龙眼胚性愈伤组织β-tubulin3的ORF-cDNA全长1508 bp，命名为dl-β-tubulin3，它含有一个全长为1350 bp的开放阅读框(登录号:KC127682)，编码446个氨基酸.此外，将2次克隆结果进行比对与拼接，获得龙眼胚性愈伤组织β-tubulin6的ORF-cDNA全长1441 bp，命名为dl-β-tubulin6，它含有一个全长为1351 bp的开放阅读框(ORF)(登录号:KC921220)，编码446个氨基酸.对这2个基因编码的氨基酸序列和核苷酸序列分别进行blastp和blast分析，结果显示，该序列与GenBank中已有的tubulin氨基酸和tubulin核苷酸均有很高的同源性，并且该片段与毛果杨、拟南芥、葡萄等的β-tubulin基因ORF的cDNA核苷酸和相应氨基酸序列高度源性(图2)，推断dl-β-tubulin3与dl-β-tubulin6 ORF验证正确.2.3 β-tubulin3与β-tubulin6基因编码蛋白质基本理化性质及结构特征利用ExPASy ProtParam软件对β-tubulin3与β-tubulin6推导的氨基酸序列进行基本理化性质分析，推测表明:(1)β-tubulin3编码的蛋白相对分子质量约为50.1 ku，含446个氨基酸残基;该蛋白带37个正电氨基酸(Arg+Lys)和60个负电氨基酸(Asp+Glu)，理论等电点4.81，总平均亲水性－0.335，不稳定系数35.99，属于亲水且稳定的酸性蛋白.(2)β-tubulin6编码446个氨基酸，相对分子质量约为50.2×103D;该蛋白带36个正电氨基酸(Arg+Lys)和63个负电氨基酸(Asp+Glu)，理论等电点4.79，总平均亲水性－0.389，不稳定系数39.53，属于亲水且稳定的酸性蛋白.此外，Protein Structure Prediction Server和SWISS-MODEL预测结果表明，β-tubulin3和β-tubulin6基因编码蛋白均无NORS区域，主要由37.9%的螺旋、18.8%的延伸链和43.3%的环等构成，并且蛋白的二级结构和三维结构的预测结果基本相似.因此，推测β-tubulin3与β-tubulin6在龙眼体胚发生过程中的表达差异可能不是通过蛋白构象的改变进行调控.图2 龙眼β-tubulin3和β-tubulin6与毛果杨、拟南芥、葡萄的多序列比对Fig.2 Longan β-tubulin3 and β-tubulin6，Populus trichocarpa，Arabidopsis thaliana and Vitis vinifera multiple sequ ence alignment“tu3”代表龙眼β-tubulin3;“tu6”代表龙眼β-tubulin6;“ath”代表拟南芥(Arabidopsis thaliana);“ptr”代表毛果杨(Populus trichocarpa);“vvi”代表葡萄(Vitisvinifera)，“ ”代表功能位点，“ ”代表tubulin基因家族的典型保守结构域.2.4 β-tubulin3与β-tubulin6基因编码蛋白质的保守结构域InterProScan预测结果表明，该类β-tubulin基因编码的蛋白质属于Tubulin_FtsZ超基因家族，含有该家族成员典型的2个保守结构:NNWAKG和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE，这2个结构域在不同物种的同源性很高.此外，还有1个GTP结合位点GGGTGSG，具有GTP酶活性，在β-tubulin和α-tubulin 聚合中发挥重要作用.因此，可推测该蛋白可能参与GTP分解和信号转导等生物学过程.2.5 β-tubulin3与β-tubulin6编码氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰NetPhoS 2.0和PredictProtein预测结果表明，β-tubulin3与β-tubulin6编码蛋白均含有3个N端糖基化位点、1个cAMP-and cGMP蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、9个N端酰基化位点(N-myristoylation site)，并且这些位点在不同物种间有较高同源性(图2).此外，本研究还发现β-tubulin3与β-tubulin6基因编码的蛋白间存在1个功能位点，该位点具有2个不同碱基，推测这2个碱基的差异可能是导致这2个基因在龙眼体胚发生过程中表达差异较大的原因.2.6 β-tubulin3与β-tubulin6同源性分析与系统发育树的建立根据blastp比对结果表明，龙眼β-tubulin3和β-tubulin6与GenBank中已有的tubulin氨基酸序列具有较高同源性.为了更好地了解β-tubulin3与β-tubulin6基因编码蛋白进化中与哪些物种接近，采用Mega 5.0近邻相接法(Neighbor-Joining，NJ)对9个不同物种的微管蛋白基因氨基酸序列进行进化树的构建(图3).该树可分为3大分支:包菜和葡萄单独为一分支;大豆、毛果杨、巨桉、玉米为同一分支;龙眼β-tubulin3和β-tubulin6与拟南芥、陆地棉为同一分支.其中，龙眼β-tubulin3和β-tubulin6同源性很高，这表明龙眼β-tubulin3和β-tubulin6编码的氨基酸序列在进化过程中具有高保守性，可能来自相同祖先.图3 龙眼胚性愈伤组织β-tubulin3，β-tubulin6基因与其它物种构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationship based on the amino acid sequence alignment of tubulins from various organisms3 讨论3.1 β-tubulin在细胞转录后水平调控中的作用机理生物信息学预测表明，龙眼β-tubulin3与β-tubulin6基因编码的蛋白均含有1个GTP结合位点，并且在该蛋白N端的磷酸化位点均为MREIL，该位点在不同物种间具有较高同源性.根据相关报道，MREIL属于微管蛋白转录后调控信号［19－20］.因此，推测龙眼β-tubulin3和β-tubulin6与其他植物的β-tubulin基因编码的微管蛋白在转录后信号调控方面可能行使相同的功能.GTP结合位点除在探索水解反应和研究微管蛋白与其它核酸蛋白(包括G-proteins关系)中发挥着重要作用［21］外，还参与β-微管蛋白和α-微管蛋白组合、胞内蛋白运输、核质运输和信号转导等生物学过程［9］，龙眼β-tubulin3和β-tubulin6编码的氨基酸序列均含有该位点，推测β-tubulin3与β-tubulin6编码的蛋白可能通过不同亚基微管蛋白组合与微丝一起作用影响细胞分裂和分化，从而影响龙眼胚性愈伤组织分化的状态.蛋白质磷酸化是广泛存在的一种蛋白质翻译后修饰，通过蛋白质的磷酸化和去磷酸化，改变蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在细胞信号传导、基因表达、细胞分化和细胞生长等的调控中起着重要作用，微管蛋白也存在类似的调控方式，但这种调控作用主要表现在动物界［22］.研究表明，从细胞分裂间期到有丝分裂期这段过度时期中，cyclin蛋白激酶(Cdk1)将会对微管产生较大影响［23］.Cyclin蛋白激酶是进行有丝分裂的关键酶，因为该酶在形成纺锤丝体的过程中发挥着重要的作用［24］.根据龙眼β-tubulin3和β-tubulin6的生物信息学预测，许多磷酸化位点中存在6个蛋白激酶C磷酸化位点，其中SPK位点是Cdk1作用的一个重要位点［25］，该位点在多种物种间是保守的，这与该位点在进化过程中是保守的研究相一致［25］.研究表明［17］，龙眼花芽的微管蛋白基因α-tubulin不存在与龙眼β-tubulin相似的磷酸化位点SPK，由此推测该位点仅存在于龙眼β-tubulin中.3.2 β-tubulin的保守性及其应用价值微管蛋白是自然界最保守的蛋白之一［17］，因此，编码该蛋白的基因经常被用作看家基因(house-keeping gene)，在Northern印迹杂交(Northern blot)、抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)、基因芯片(microarray)和荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)等分子生物学试验中作为内参基因使用［26］.微管蛋白基因与许多物种无论是单子叶植物还是双子叶植物都具有很高的同源性.在高等植物中，微管蛋白基因家族中的某些成员具有很高的同源性.例如拟南芥的9个β-微管蛋白基因中，TUB1、TUB5有高达95%的同源性，TUB4、TUB9也达到87%.这9个基因在严格保守的位置上都含有2个内含子，被认为是由同一个共同祖先进化而来［27－30］，这与发育树聚类结果相同.在龙眼体胚发生方面，可以利用tubulin的同源性研究某个微管蛋白基因的结构异构体(亚基)类型在体胚发生中的作用;也可以利用该基因的保守性，研究龙眼“红核子”品种与其它龙眼品种或者与无患子科其它物种的进化关系.参考文献【相关文献】［1］简令成.植物细胞骨架［J］.植物学通报，1991，8(3):1－13.［2］翟中和，王喜中，丁明孝.细胞生物学［M］.北京:高等教育出版社，2000:318－334.［3］LEDBETTER M C，PORTER K R.A“microtubule”in plant cell fine structure［J］.Cell Bio，1963，19(1):239－250.［4］陈志玲，刘丽娜，刘磊.微管骨架在棉纤维细胞伸长中的作用［J］.首都师范大学学报:自然科学版，2007，28(1):50－54.［5］黄聪聪，吴忠义，陈洁，等.植物微管结合蛋白的研究进展［J］.植物学通报，2008，25(3):354－362.［6］KOPCZAK S D，HAAS N A，HUSSEY P J.The small genome of Arabidopsis contains at least six expressed alpha-tubulin genes［J］.The Plant Cell Online，1992，4(5):539－547.［7］时兰春，王益川，王伯初.植物细胞骨架与细胞生长［J］.植物生理学通讯，2007，43(6):1175－1181.［8］SILFLOW C D，OPPENHEIMER D G，KOPOZAK 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龙眼胚性愈伤组织DlHOS1基因克隆与表达分析肖小娥;徐小萍;李佳蜜;张梓浩;赖瑞联;林玉玲;赖钟雄【摘要】以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE-PCR技术对植物抗寒重要调控因子HOS1(DlHOS1)进行克隆,并进行密码子使用偏爱性、生物信息学和低温胁迫下表达等方面的分析.结果表明:DlH OS1基因序列全长3 577 bp,包含ORF 3 000 bp,编码999个氨基酸,5'UTR和3'UTR分别162 bp和415bp(GenBank登录号:KY990404);密码子使用偏爱性分析表明,DlHOS1密码子的选择偏爱性较弱,偏爱以A/T结尾;生物信息学分析结果表明,DlHOS1编码的蛋白属于不稳定的疏水性跨膜蛋白,不含信号肽,定位于细胞质和细胞核,二级结构富含α螺旋,与柑橘的亲缘关系较近;qPCR结果发现,DlHOS1能够响应低温胁迫诱导,总体上低温下其表达水平上升.研究结果认为,DlHOS1参与龙眼抗寒和低温胁迫过程.%To study the function of HOS1 in cold stress of Dimocarpus longan Lour.,the embryogenic callus of D.longan Lour were used to clone HOS1 gene (DlHOS1),and codon bias,bioinformatics and expression pattern of DlHOS1 were analyzed.The results showed that the full length sequence of DlHOS1 was 3 577 bp,containing an ORF 3 000 bp,encoding 999 amino acids,and the 5' UTR and 3' UTR was 162 bp and 415 bp respectively (GenBank accession number:KY990404).The codon bias level of DlHOS1 was low,and it biased toward the synonymous codons with A and T at the third codon position.Bioinformatics analysis indicated that DlHOS1 was an unstable and hydrophobic transmembrane protein,had no signal peptide and multilocated in cytoplasm and nucleus.The secondary structure was mainly composed of alpha helix and strand.Besides,DlHOS1 shared a very closerelationship with citrus.qPCR analysis showed that DlHOS1 was response to the induction of low temperature and up-regulated at low temperature.The research suggested that DlHOS1 should be involved in cold resistance and low temperature stress in longan.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2018(039)002【总页数】7页(P293-299)【关键词】龙眼;DlHOS1;基因克隆;密码子使用偏爱性;qPCR【作者】肖小娥;徐小萍;李佳蜜;张梓浩;赖瑞联;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002;福建省农业科学院果树研究所,福建福州 350013;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S667.2温度是植物生长发育的必要因素之一，当温度降低到超出了植物生长所能承受的范围后，植物就会受到伤害甚至导致死亡。

龙眼胚性愈伤组织中ELF4家族基因克隆及其表达分析陈裕坤;林玉玲;赖钟雄【摘要】ELF4家族是植物特有基因,能调节生物钟、调控开花时间、感受光周期和参与幼苗去黄化等.以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR结合RACE法克隆了ELF4家族3个成员cDNA全长,分别命名为DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4.DlELF4全长599 bp,编码140个氨基酸;DlELF4-LIKE 1全长762 bp,编码142个氨基酸;DlELF4-LIKE 4全长661 bp,编码114个氨基酸;DlELF4家族成员均为不稳定的亲水蛋白,无信号肽与跨膜结构,都含有DUF1313保守功能结构域.进化树分析表明,植物中ELF4家族可分成二个亚组,ELF4与ELF4-LIKE 1聚为一组,ELF4-LIKE 2、3、4聚为另一组.qPCR结果表明:在体胚发生过程中DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE4表达模式相同,均在球形胚时期表达量极高,而在其它时期表达量很低;DlELF4家族对不同光质和不同处理时间的响应存在差异:DlELF4的表达经24h处理时可能受绿光和红光诱导,经72h处理时可能受红光、蓝光和白光诱导;DlELF4-LIKE 1的表达在24h处理时可能受绿光诱导,经72 h处理时受红光和绿光抑制;DlELF4-LIKE 4的表达在24h和72 h处理时可能受蓝光和白光诱导.水杨酸和茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达.以上结果表明,ELF4家族可能参与龙眼体胚发生过程中球形胚的形态建成与胁迫应答.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2015(036)009【总页数】9页(P1593-1601)【关键词】龙眼;体胚发生;ELF4家族;克隆;表达分析【作者】陈裕坤;林玉玲;赖钟雄【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S602.3doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.008EARLY FLOWERING 4（ELF4）最早由Doyle于2002年发现并命名的[1]，该基因主要参与植物的光周期感知、生物钟调节，不仅能提升植物生物钟的精度，在缺少昼夜周期时对生物节律的维持又是必不可少的[1-4]；elf4突变体中中央振荡器元件C IRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）的表达量减弱[1]。

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析赖呈纯;赖钟雄;方智振;林玉玲;姜顺日【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2010(043)016【摘要】[目的]克隆龙眼(Dimocarpus longanLour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况.[方法]采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律.[结果]成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2 099bp,由1 677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸.该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高.对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支.qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高.[结论]龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高.【总页数】10页(P3392-3401)【作者】赖呈纯;赖钟雄;方智振;林玉玲;姜顺日【作者单位】福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州,350002;福建省农业科学院农业工程技术研究所,福州,350003;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州,350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州,350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州,350002;福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福州,350002【正文语种】中文【相关文献】1.龙眼体胚Obg1基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析 [J], 方智振;赖钟雄2.龙眼胚性愈伤组织AGO6基因克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 [J], 杨曼曼;林玉玲;王天池;赖钟雄3.龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析 [J], 李惠华;赖钟雄;林玉玲;苏明华4.龙眼胚性愈伤组织miR398b前体克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析[J], 林玉玲;赖钟雄5.龙眼胚性愈伤组织miR398a前体的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析[J], 林玉玲;赖钟雄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。