罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)
一、原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂
器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；
试剂：试剂盒含：
1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、
2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、
3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；
自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、
Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH ）或细胞通透液（% Triton X-100 溶于% 柠檬酸钠，临用前配制）、
苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，
pH ，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、实验步骤
操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：
1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理
4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的
Proteinase K（400μg/mL）处理5 分钟。其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即
蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透
液：%TritonX-100 溶于%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min （胃蛋白酶：%%溶于HCl PH2，胰蛋白酶%%溶于HCl ）
替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中，
置于微波炉中350W（低档）处理5 min。
5. PBS漂洗2次；
6. 制备TUNEL反应混合液：
处理组用50μl 1号液+450μl 2号液混匀；
而阴性对照组仅加50μl 2号液，
阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为
450~500nm，检测波长为515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl 3号液（converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在组织处加50~100μl DAB底物，反应15~25℃×10min；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计
200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色
细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）
对于培养细胞的预处理：
①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；
③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min；
④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤将吸附细胞的载玻片在%的Triton X-100中处理5min；
⑥PBS浸洗二次，每次5min；
后续操作如同石蜡包埋切片的6-15
四、注意事项
1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
