:4V O9 I， O< 个循环； :4V : JHT 。 O9 I、 21E >*$ 产物的克隆和鉴定测序
将 (&) 和 ,D> 启 动 子 基 因 >*$ 产 物 采 用 #AD 互 补 直 接 克 记 为 =,D#A# 和 =,D>A#， 将连接产物转 隆 法 连 接 到 =5;23A#， 化大肠杆菌 ;+<! ，挑取阳性转化子，提取质粒，用 *+,$" 和
+!,
其理化性质及作用机理均 +"**,-’） 342 #566 分 泌 的 乳 杆 菌 素 +7,， 不是很清楚。 为了进一步研究 -.**()/0/1 2 的作用机制及遗传特 性， 我 们 采 用 89% 方 法 从 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （ .’#/’" 0"*$%-’* ） 染色 体中扩增了 -:8 启动 子 ， 以 其 取 代 诱 导 型 表 达 载 体 ;8<9"= 上 的 ;:>?! ，构建 了 组 成 型 表 达 载 体 ;-:8"=
!"#$%&’(’ )* !"#$ +&#& )* ,-.$&/().(# +-’’&/(.(# 0 -#1 2)#’$/3.$()# )* ($’ 2)#’$(4 $3$(5& 678/&’’()# 9&.$)/ :’(#; $%& +<= =/)>)$&/
!23 !’45"6!7 81 9 : ,64;)!7 <81 = >)’4(’!7 : 1 9? 8"%#
［F&" G)/1’］ N.0M()/&0/1] -.**()/0/1 2] ’(1( *T1M\(*/*] 0&1*M/MQM/Z( (_;)(**/&1] -:8 ;)&^&M() 乳酸菌是一类能发酵糖产生大量 乳 酸 、 分 解 蛋 白 质 但 不 产 生有毒物质的细菌。长期以来， 乳酸菌被广 泛 应 用 于 乳 制 品 、 蔬 菜及肉制品 的 发 酵 与 防 腐 中 。 早 在 !"#$ 年 ， %&’()* 于 美 国 首 次 报道了乳酸链球菌的代谢产物能抑制乳 酸 菌 ； 后 来 的 有 关 研 究 表明， 该代谢产物是细菌素 。细菌素是由 某 些 细 菌 在 代 谢 过 程
+@,
。将人工合成的
中通过核糖体合成机制产生的一类具有 抑 菌 活 性 的 多 肽 或 前 体 多肽， 其抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌 ， 而产生菌对其细菌 素有自身免疫性 +#,。大多数乳酸菌在代谢过程中都能合成这种物 质， 通称为乳酸菌素， 它有抑制和杀死食品 中 多 数 革 兰 阳 性 致 病 菌和腐败菌的作用， 少数乳酸菌素对革兰阴 性 菌 也 有 抑 制 作 用 。 近年来， 随着越来越多新的乳酸菌素被发现 ， 乳酸菌素已经引起 广大乳酸菌、 食品添加剂、 益生素及新药开 发 等 领 域 研 究 人 员 的 极大兴趣， 出现了研究热潮。 （!"#$%&"#’(()* 乳 酸 菌 素 -.**()/0/1 2 是 一 种 由 加 氏 乳 杆 菌
-.**()/0/1 2 的 功 能 编 码 基 因 +"$ 与 编 码 酵 母 ! 因 子 前 导 肽 的 AB: 片 段 融 合 ， 该 融 合 基 因 6C 端 加 入 =&D.E 序 列 后 再 克 隆 到
构建出正确的毕赤酵母组成型表达载体。 -:8 启动子下游，
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材料与方法
材料
［收稿日期］ #55KG5"G5! ［作者简介］刘丽凡 （!"$!G ） ， 女， 硕士研究生 ［通讯作者］韩文瑜， （cG^./P ） \.1‘TdePQF(RQF01
!F 8)&P&’Q( .1R S(M()/1.)T U(R/0/1( 9&PP(’( &V W/ X/1 Y1/Z()*/MT[ 9\.1’0\Q1 !755K#] #F :1/^.P 30/(10( .1R 2(0\1&P&’T 9&PP(’( &V W/ X/1 :’)/0QPMQ)( Y1/Z()*/MT[ 9\.1’0\Q1 !755K#] 9\/1.
组成型表达载体的构建和序列测定 用 0&+ " 和 .&/+" 从 =5;23A# 重组质粒上切下 ,D> 启动 子基因片段， 经回收、 纯化后， 与 经 同 样 酶 切 的 =>&*?@ 载 体 连 重组质粒经酶切鉴定， 获得的重组表达 接， 转化大肠杆菌 ;+<! ， 载体命名为 =,D>?@ 。重组质粒序列由 #6@6$6 公司测定。
生
物
技
术
通
讯
Xc22c%3 <B 4<>2c9LB>X>-f
S&PF!$ B&F# U.)F[ #55I
##I
文章编号 !!55"G555#H#55IJ5#G5##IG57
研究报告
乳酸菌素 -.**()/0/1 2 基因的人工合成及其组成型表达载体的构建
刘丽凡 !， 韩文瑜 !， 赵瑞丽 !， 王好 "
*+,$" 和 -,)" 酶 切 位 点 ， 人 工 合 成 R 条 寡 聚 核 苷 酸 引 物 如 下
为 Q2SQO ； 反链 O 条， 为 $2S$O ； 长度均为 <? TU） ： （正链 O 条，
!"： ##$%#$%&&$&%%##%##%#%%##%##%#$%&$%#%%#$%##%%###$%%%###%&&$# ’’’!(： %#)))*%%%##*%))*)%%#%%##%##%)#)))*))*%###*%#*%))*)%%##%##%# *##*#))%%*)**)%#))#))*%%%))*)*%%%#%*%%%%#)))*%%%##*%))*)%%# ’’’!+： ’’’,-： )%#)#*)**))*))))**)*))#*%##)**)*)))*)#*#%%)***)))#***))**)# )#%)#*)#*)#%))*)**)#***))#*))%%##))*#%))%#)#*)**))*))))**)* ’’’,(： ’’’,.： ##*##**#*%%)%%)*%%%*%))%*%%)**))))**)**)#%)#*)#*)#%))*)**)#
214 21412
基因合成 引物设计 根据 -6ILIMH 等 NOP报道的 (&) 基因序列， 按照毕
把编码 (&) 基因第 :< 位氨基酸残基的密码 赤酵母偏爱密码子 N<P， 子转换成毕赤酵母偏爱的形式。在引物 QO 和 $O 两端分别加入
.&/+" 双酶切鉴定。将重组质粒送 #6@6$6 公司测序。 21<
万方数据
443
大肠杆菌 ;+<! 、酵母表达载体 =>&*?@ 及毕赤酵母 ,%22< （!"#$ ） 由本实验室保存。 ->; 培养基平板 （29 B C ! 酵母提取物，
A
生
物
技Leabharlann 术通讯!"##"$% &’ (&)#"*+’)!),-
./0123 ’/14 56718 499:
,D,*#*,D#**######,#D,AOX ； OW 引 物 ： <XA,,**,,D#**#,#
吉林 长春 !755K# ； #F 吉林农业大学 动物科技学院， 吉林 长春 !755K# !F 吉林大学 农学部畜牧兽医学院， ［摘要］ 目的： 为了研究乳酸菌素 -.**()/0/1 2 的作用机制及应用价值， 人工合成 -.**()/0/1 2 基因并构建能高效表达外源 经测序正确后与已线性化的 蛋白的毕赤酵母组成型表达载体。方法： 应用 89% 方法从毕赤酵母染色体中扩增 -:8 启动子， 把 不 含 ;:>?! 启 动 子 的 毕 赤 酵 母 诱 导 型 表 达 载 体 ;8<9"= 连 接 ， 转 化 大 肠 杆 菌 AL6! 。 根 据 -.**()/0/1 2 的 基 因 序 列 ， 设 计 了 K 条 6" 1M 的 寡 聚 核 苷 酸 引 物 ， 通过 7 次连续 -.**()/0/1 2 的结构基因 +"$1 的 密 码 子 转 换 成 毕 赤 酵 母 偏 爱 的 形 式 ， ，经测序正确后插入 ;-:8"= 质粒的多克隆位点。结果：用 -:8 启 动 子 89% 反应，人工合成 +"$1 片段 （简称 +"$ 基因） 取代了 ;8<9"= 上的 ;:>?! ， 构建了毕赤酵母组成型表达载体 ;-:8"= ； 将 （;-:8） 89% 拼接获得 #65 N; 的目的基因序列， 目的基因克隆于 ;-:8"= ， 获得组成型表达载体 ;-:8"=G’.M 。 结论： 为下一步在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白， 研究其作 用机理和遗传机制奠定了基础。 基因合成； 组成型表达； 启动子 ［关键词］ 乳酸菌素； -.**()/0/1 2； ［中图分类号］ OI$ ［文献标识码］ :
［<?’$/-.$］ @?A&.$(5&B 2& 0&1*M)Q0M . )(0&^N/1.1M (_;)(**/&1 Z(0M&) &V .’#/’" 0"*$%-’* (_;)(**/1’ N.0M()/&0/1 -.**()/0/1 2
