Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent)

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。

对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。

在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。

共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。

蛋白质可用于Western Blotting。

规格：100ml 黄色透明液体储存条件：2-8℃避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。

如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。

忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。

预防RNase污染注意事项：1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3．RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

总RNA的提取方法（Trizol）
1、取1g植物材料，倒入液氮剧烈研磨，成粉（研磨成粉称重，无液氮时继续添加），转入离心管中，加入1ml Trizol混匀（除DNA）。

2、室温放置5min。

3、加200ul氯仿（1ml Trizol+0.2ml氯仿目的：除酚）剧烈震荡15s，室温放置3min（时间的控制）。

4、12000rpm，4℃,15min，取上层水相，大约600ul，下层有机相弃去。

5、加异丙醇（-20℃）混匀，室温放置10min（1ml Trizol+500ul异丙醇，目的：除盐，若盐少，可用无水乙醇）
6、12000rmp，4℃,10min，弃上清，RNA在管底和管壁形成胶状沉淀。

7、加1ml75﹪乙醇洗涤沉淀（用枪头吹打）低速离心5min，弃上清，4℃，,7500rmp，一般为7000rmp。

8、室温放置，晾干5至10min（不要过干，否则RNA难溶，另外，乙醇残留时会对RNA逆转录酶抑制）。

9、加25-30ulDEPC水，可用枪头吹打帮助溶解。

①看到沉淀时加30-50ulDEPC 水；②看不到沉淀时加20-25ulDEPC水。

注意事项：
1、DNA制备所需的水、溶液，都必须用DEPC 37℃预处理。

2、操作过程中要用到的Eppenolorf管，枪头必须经DEPC处理
3、玻璃器皿需高温干热（200℃）灭菌2-3h。

4、塑料制品和电泳槽等需要0.5mol/L的NaoH处理1-2h，然后用无菌水漂洗干净。

5、操作台和枪先用氯仿擦一遍。

6、操作中常换一次性手套，手是主要的污染源。

7、戴口罩，避免口中的RNA酶污染。

TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA简介TRIzol是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA试剂，可以从动物组织，真核细胞等中提取总RNA。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA。

加入氯仿离心后，溶液会形成上清层，中间层和有机层，RNA 分布在上清层中，收集上清层经异丙醇沉淀后便可以回收得到总RNA。

材料（1）试剂：RIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、PBS 缓冲液等。

（2）器材：RNase Free EP管、冷冻离心机、组织匀浆器等。

实验步骤1、样品处理（1）细胞：收集细胞沉淀，加入1ml TRIzol吹打混匀。

（2）组织样品：取一小块样品于1.5ml离心管中，剪碎，加入TRIzol后匀浆器匀浆。

2、抽提RNA（1）室温孵育5min，加入200ul氯仿/1ml TRIzol，震荡混匀，室温静置3min。

（2）（提前预冷离心机）4°C ，12000×g离心15 min，离心后液体分为三层，小心吸取上层水相至新的EP管。

RNA在上层水相，中间层为DNA，下层为蛋白质。

吸上清时，不可吸到中间层，宁可少吸也不能多吸。

（3）加入500ul异丙醇/1ml TRIzol，上下颠倒混匀，冰上孵育10min。

（4）4°C ，12000×g离心10 min，弃上清。

（5）加入1ml 75%乙醇轻柔洗涤沉淀，短暂涡旋使沉淀漂起。

（6）4°C ，7500×g离心5 min，吸弃上清，静置干燥沉淀。

沉淀不能过干或过湿，待沉淀会变为半透明色即可。

（7）视沉淀量加入适量DEPC水溶解，轻轻吹打，-80°C长期保存。

3、总RNA 纯度、浓度和完整性检测（1）One Drop检测RNA纯度和浓度：纯净RNA的A260/A280的比值为2.0，小于1.9说明存在有机物污染，大于2.1则说明RNA发生了降解。

Trizol 法提取RNA(赵桂红)一、准备工作：1、严格戴好口罩，手套。

2、实验所涉及的移液器杆，电泳槽，实验台面等均需75%的酒精处理，凝胶槽和梳子均需DEPC水浸泡。

3、准备试剂：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC水配制），RNase-Free水。

二、DEPC水的配制：配1L的DEPC处理水，加1mlDEPCA（共配8L）。

烧杯中放入转子，磁力搅拌器搅拌过夜。

第二天分装在培养瓶高压蒸汽灭菌（121℃,25min）（DEPC分解成CO2和乙醇）。

三、50×TAE 缓冲液(PH8.5)的配制组分浓度：2 M Tris-醋酸、100 mM EDTA配制量：1L配制方法：①称量下列试剂，置于1L烧杯②向烧杯中加入800ml去离子水，充分搅拌溶解③加入57.1ml的醋酸，充分搅拌④加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存五、植物材料的研磨1、将酒精倒入研钵点燃灼烧灭菌，重复三次(准备一个湿抹布)。

2、将离心管放入液氮，速冻，以防粘壁。

3、取0.1g幼嫩植物体放入研钵，倒入液氮速冻，待液氮将要挥发完时，迅速研磨。

4、从液氮中取出离心管，将研磨好的材料分装，再放入液氮六、RNA的提取：1、向装有研磨好的材料的离心管立即加入1ml的Trizol试剂(使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性)。

2、涡旋数秒，在4℃、12000×g条件下离心10min。

3、离心后将上清液转移至新离心管中。

（上层如出现脂质层，将其移去）4、加200µl的氯仿（有效的使有机相和无机相迅速分离），盖上盖子，涡旋15s，室温放置2-3min。

5、在4℃、12000×g条件下离心15min。

（一般分层，下层红色，中间交换层，及上清，上清一般占总体积50%）6、吸上清液移至新离心管。

（避免吸入中间层和下层）7、加500µl异丙醇（沉淀RNA），室温放置10min。

提取RNA中所用各种试剂的作用：
1、氯仿：
氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。

DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。

但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。

不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA 的亲水基团，与水相接触。

所以不要剧烈震荡。

氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用
通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作。

2、
异丙醇：异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受
到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾
异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。

只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。

在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。

不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来的时候。

3、酸酚：沉淀蛋白的同时，酸性也有助于去除
DNA。

RNA抽提指南(TRIZOL)警告:有毒物接触皮肤或者不慎吞服。

会导致灼伤。

一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。

若感不适，看医生并寻求苯酚和其他成分（NJTSRN 80100437-5000p)的正确治疗方案。

TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。

尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2—8°C的环境下。

一般描述：TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA 存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

TRIZOL 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。

TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb 和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb 之间 (tRNA, 5S)。

Trizol使用说明书一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。

RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。

用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

1、 料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。

注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通风柜中室温处理过夜。

4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。

置于干净处备用。

2、 璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。

四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

Trizol 提取RNA的步骤和技巧T ri zo l/T ri p u r eTrizol/TriPure 试剂适用于从不同的生物样本(包括人类、动物、植物、酵母、细菌和病毒来源的样本) 中分离总 RNA 或同时分离RNA、DNA 和蛋白质。

试剂仪器准备氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC 水），无RNase 水或0.5%SDS, 12000g 高速离心机，聚丙烯离心管，水浴（55-60 度），*密度梯度离心试剂（用于白血细胞提取），*糖原（用于小于10mg 的组织样本）匀浆裂解样品根据样品类型的不同，在室温下完成匀浆裂解操作；样品体积不能超过Tripure试剂的10％；同时，按建议体积量加入Tripure试剂，保证充分裂解，避免DNA污染。

对高脂肪、蛋白、多糖、胞外基质的样品（例如肌肉，脂肪，块茎类植物等），需要额外步骤去除不溶性成份。

（如果后续还要提取DNA，则省略该步骤）在此，可以继续进行实验，或将匀浆样品在-80度保存（一月以上）。

溶液相分离1、匀浆样品在室温下放置5min，使核蛋白复合体充分分解。

2、每1ml Tripure匀浆液中加入0.2ml氯仿，盖紧离心管。

3、手动剧烈摇荡离心管15s。

4、室温下放置2-15min。

5、4度12000g 离心样品15min。

6、离心后匀浆液分层，最上层是无色的水相，RNA主要分布在其中，约占总体积的50%。

7、倾斜离心管45度，小心吸取上层水相至新的离心管，避免吸取其他各相液体。

8、如果要分离DNA和蛋白，保留剩余液体；有机相可以在4度过夜保存。

R N A沉淀1、对小量提取的RNA（小于约10^6细胞，或10mg组织），添加入5-10ug 无RNase 的糖原作为共沉淀的载体。

2、每1ml Tripure匀浆样品，加入0.5ml异丙醇到离心管。

3、室温放置10min。

4、4度12000g 离心样品10min。

R N A清洗1、轻轻吸取上清，加1ml 75%乙醇/1ml Tripure匀浆样品到离心管。

组织和细胞总RNA提取（TRIzol法）TRIzol RNA 提取试剂盒是由GIBCO BRL 公司推出专供提取RNA 的产品，其操作方便、快捷。

（一）试剂准备1 ．TRIzol 试剂。

2 ．氯仿3 ．异丙醇4 ．75% 乙醇（DEPC H2O 配制）5 ．DEPC H2O（二）操作步骤1 ．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×10 7 ，移入1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol ，混匀，室温静置5min 。

（２）组织：取50-100mg 组织（新鲜或-70 ℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol 充分匀浆，室温静置５min 。

2 ．加入0.2ml 氯仿，振荡15s ，静置2min 。

3 ．4 ℃离心，12000g × 15min ，取上清。

4 ．加入0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min 。

5 ．4 ℃离心，12000g × 10min ，弃上清。

6 ．加入1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。

4 ℃，7500g × 5min ，弃上清。

7. 晾干，加入适量的DEPC H 2 O 溶解（65 ℃促溶10-15min ）。

（三）注意事项1 ．样品量和Trizol 的加入量一定要按步骤（1 ）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降解。

2 ．实验过程必须严格防止RNsae 的污染。

二、总RNA 定量RNA 定量方法与DNA 定量相似。

RNA 在260nm 波长处有最大的吸收峰。

因此，可以用260nm 波长分光测定RNA 浓度，OD 值为1 相当于大约40 μ g/ml 的单链RNA 。

如用1cm 光径，用ddH 2 O 稀释DNA 样品n 倍并以ddH 2 O 为空白对照，根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA （mg/ml ）=40 × OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000RNA 纯品的OD 260 /OD 280 的比值为2.0 ，故根据OD 260 /OD 280 的比值可以估计RNA 的纯度。

Trizol 分离纯化的基本原理：研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离及纯化RNA。

RNA质量的高低常常影响cDNA库、RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

Trizol是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

购买规格为100ml/瓶或者200ml/瓶，1ml Trizol可以提取50-100mg组织，基本上是1个样品用1mlTrizol。

使用Trizol试剂的准备工作：RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。

它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除後又迅速复性。

用常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。

它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

一般情况下采用用DEPC配制的70％乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

取RNase-free的物品时必须戴手套。

使用Trizol试剂时塑料制品的处理：尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-free的塑料制品，如果没有开封使用过，通常没有必要再次处理。

对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。

处理步骤如下：（1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。

注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

（2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

（3）在通风柜中室温处理过夜。

（4）将DEPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

（5）烘箱用合适的温度烘烤至干燥。

置于干净处备用。

使用Trizol试剂时玻璃和金属物品的处理：250℃烘烤3小时以上。

植物总RNA 的提取抽提RNA 所用的研钵酒精灼烧5-10min。

，其他器皿均用0.1%的DEPC 水处理,24hr。

后高温高压灭菌两次，以去除RNA 酶,所有试剂都保证没有RNA 酶污染。

1） 1.5ml 离心管中加入1ml Trizol,取0。

1g 组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol中，立即充分混匀。

2）将混匀的组织在 15—30℃放10min，使核酸蛋白复合体物完全分离.3） 4℃,10000rpm 离心20min，取上清。

4）加氯仿 200μl，5M NaCl 200μl，剧烈振荡15s，室温放置3min(或不放置，直接离心）.5) 4℃，10000rpm 离心20min,样品会分成3 层，取上层水相,取上清。

176) 加 500μl 异丙醇，混匀,室温放置10min。

7） 4℃，10000rpm 离心15min，去上清，管底管侧形成胶状沉淀。

8）加 1ml 75％乙醇,洗涤沉淀,重复两次，洗涤用4℃,7500rpm 离心5min，弃上清。

9）吹干约 15min。

10) 加 50μl DEPC 处理的水，65℃溶解,-20℃(最好—80℃)保存.DNase I 处理消化植物总RNA 中的基因组DNA1) 取5μl 的植物总RNA，然后顺序加入1μl 10×缓冲液,1μl DNase，3μl RNase—free水，总体积10μl，充分混匀后,37℃温育30 min.2) 加入1μl 终止缓冲液，65℃温育10min，使DNase 失活.反转录 cDNA1）在上述总体积为11μl 反应液中加入1μl Oligo（dT)18 引物4μl 5×缓冲液，2 μl dNTP,1μl 反转录酶,1μl RNase 抑制剂,总体积20μl,充分混匀后，42℃温育1—1。

5hr。

2) 70℃温育10min,终止反应trizol法提取RNA步骤2010年03月09日星期二 17：07从组织中提取总RNA1）液氮研磨，组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转移入离心管进行第2步操作。

Trizol法提取总RNA原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织，5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。

一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。

保存条件：2~8℃避光保存12个月。

实验前需要准备的试剂：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水。

实验前需要准备的物品：1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）样品前处理注意点：1.选择新鲜血液，不得超过4小时。

2.选择新鲜组织，生长旺盛的组织。

3.选择新鲜的幼嫩组织。

4.选择处于生长旺盛的时期收集细胞。

RNA纯化要求：1.纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。

2.排除有机溶剂和金属离子的污染。

3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。

4.排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事项：1.杜绝外源酶的污染。

（1）严格戴好口罩，手套。

（2）实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。

（3）实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。

Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent) Sample PreparationCompletely solubilized samples can be kept at room temperature for, at most, a few hours. Alternatively, freeze for later use at -80°C. The RNA is stable indefinitely at -80°C.∙ 1. Prepare the samples as required:∙For tissues∙i. Snap-freeze the tissue to be extracted. Powder on dry ice. Alternatively, using a precooled mortar and pestle, grind the frozen tissue under liquid nitrogen.A less desirable alternative is to use a mechanical homogenizer.∙ii. Add 1 mL of TRIzol per 50-100 mg of tissue. For larger amounts, scale up accordingly.Never let the sample volume exceed 10% of the TRIzol volume. It is essential todissolve the tissues as quickly as possible in TRIzol.Extraction∙ 2. Solubilize the samples (from Steps 1.ii, 1.iv, or 1.v) for 5 min at room temperature.∙ 3. Add 0.2 mL of chloroform per mL of TRIzol. Mix vigorously by hand or vortex for15 sec. Allow the mixture to stand for 2-3 min at room temperature.Adding chloroform promotes phase separation. It is important that the chloroform does not contain any additives such as isoamyl alcohol, as used in Purification of RNA by SDS Solubilization and Phenol Extraction(Rio et al. 2010a).∙ 4. Centrifuge at maximum speed in a microcentrifuge or at 10,000g in a centrifuge for 10 min at room temperature.This should produce two phases: an upper clear one containing RNA and a lower red one that contains protein. DNA is at the interface.∙ 5. Transfer the upper clear phase to a fresh tube, taking care not to disturb the interface.∙ 6. (Optional) If the expected RNA concentration is ≤10 μg/mL, add a carrier (e.g., glycogen or GlycoBlue) (see Ethanol Precipitation of RNA and the Use of Carriers [Rio et al. 2010c]) to the upper phase before proceeding to Step 7.∙7. Add 0.5 mL of isopropanol per each milliliter of the clear phase. Mix vigorously by rapid shaking or vortexing. Let stand for 10 min.The isopropanol will precipitate the RNA.∙8. Collect the precipitated RNA by centrifugation at maximum speed in a microcentrifuge or at 10,000g in a centrifuge for 10 min at 4°C.The use of GlycoBlue as a carrier greatly aids in visualizing the pellet.∙9. Carefully decant the supernatant. Remove any remaining liquid with a pulled Pasteur pipette.The white (or blue, if GlycoBlue has been used) RNA pellet will appear as a triangle extending from the bottom of the tube slightly upward.∙10. Immediately resuspend the pellet (without drying) in 1X SDS solubilization buffer.Although the suppliers of TRI Reagent and TRIzol recommend washing theisopropanol pellet by vortexing with 75% ethanol, this step is not advised.Immediate resuspension followed by phenol extraction gives much cleaner RNA.Because of the extremely high salt concentration present in TRIzol, the pellet can be difficult to resuspend. Resuspension can take several minutes, but if GlycoBlue has been used, it is easy to visualize this process.∙11. After resuspension, add NaOAc to 3 M.∙12. Re-extract the solution with phenol (see Purification of RNA by SDS Solubilization and Phenol Extraction [Rio et al. 2010a]).∙13. Precipitate with ethanol (see Ethanol Precipitation of RNA and the Use of Carriers [Rio et al. 2010c]).To assess the quantity and quality of the RNA, see Determining the Yield and Quality of Purified RNA(Rio et al. 2010d).See Troubleshooting.14. Store the purified RNA in ethanol at -20°C.Alternatively, recover the RNA by centrifugation, resuspend in RNase-free H2O, and store at -20°C (or at -80°C for long-term storage).Previous SectionNext SectionTROUBLESHOOTINGProblem: RNA yield is low.[Step 13]Solution: Unexpectedly low RNA yield can occur when the initial solubilization step is not effective; e.g., it is too short or not enough TRIzol has been used. Make sure that the solution is clear and of uniform viscosity.INTRODUCTIONTRIzol solubilization and extraction is a relatively recently developed general method for deproteinizing RNA. This method is particularly advantageous in situations where cells or tissues are enriched for endogenous RNases or when separation of cytoplasmic RNA from nuclear RNA is impractical. TRIzol (or TRI Reagent) is a monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate that simultaneously solubilizes biological material and denatures protein. After solubilization, the addition of chloroform causes phase separation (much like extraction with phenol:chloroform:isoamyl alcohol), where protein is extractedto the organic phase, DNA resolves at the interface, and RNA remains in the aqueous phase. Therefore, RNA, DNA, and protein can be purified from a single sample (hence, the name TRIzol). TRIzol extraction is also an effective method for isolating small RNAs, such as microRNAs, piwi-associated RNAs, or endogeneous, small interfering RNAs. However, TRIzol is expensive and RNA pellets can be difficult to resuspend. Thus, the use of TRIzol is not recommend when regular phenol extraction is practical.Previous SectionNext SectionRELATED INFORMATIONTRIzol extraction is a straightforward way to prepare RNA from cells or tissues. Although TRIzol removes large DNA molecules efficiently, it does not remove plasmid DNA or DNA fragments efficiently, which can be problematic for subsequent polymerase chain reaction (PCR) applications. However, when used appropriately, the RNA yield is quantitative. An alternative method for Purification of RNA by SDS Solubilization and Phenol Extraction (Rio et al. 2010a) is available, as are procedures for Preparation of Cytoplasmic and Nuclear RNA from Tissue Culture Cells (Rio et al. 2010b), and Ethanol Precipitation of RNA and the Use of Carriers (Rio et al. 2010c). Further information is also available on Determining the Yield and Quality of Purified RNA (Rio et al. 2010d).Previous SectionNext SectionMATERIALSPerform all procedures under RNase-free conditions using RNase-free glassware and other equipment, and prepare all reagents with RNase-free H2O.ReagentsCells or tissues for extractionChloroformEthanolGlycogen (or GlycoBlue [Ambion]) (optional; see Step 6)H2O, RNase-freeIsopropanolPhenolSDS solubilization buffer (1X)Sodium acetate (NaOAc)TRIzol (Invitrogen) or TRI Reagent (Molecular Research Center, Inc.)TRIzol LS (for liquid samples or yeast and bacteria; see Step 1.v)EquipmentCentrifuge (for large-scale isolations)Dry iceAlternatively, liquid nitrogen can be used with a precooled mortar and pestle to prepare the tissue. A mechanical homogenizer is a less desirable alternative (see Step 1.i).Freezers preset to -20°C and -80°CHood (for chloroform and phenol steps)Microcentrifuge (for small-scale isolations)Pasteur pipettes, glass, 5- or 10-mL (pulled for Step 9)Tubes, microcentrifuge, 1.5-mL (for small-scale isolations)Tubes, polypropylene, 12-mL, equipped with caps (Sarstedt) (for large-scale isolations) Vortex mixer。

TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。

其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。

TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。

主要成分：TRIzol的主要成分是苯酚。

苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。

苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。

加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。

※ 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。

※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

乙醇能够消除核酸的水化层 使带负电荷的磷酸基团暴露出来。

Na 之类的平衡离子能够与这些带电基团结合 在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。

因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀可以利用DNA和RNA在不同浓度的氯化钠水溶液中溶解度不同进行分离，RNA 核蛋白在易于溶解在0.14mol/L氯化钠溶液中但是DNA核蛋白在此浓度中难溶，然后便可以通过离心分离将两者分开，上清液中有RNA，沉淀含DNA，这样便可以分开了并且两者都会得到较好的保留而不会分解或者变性等。

希望您能采纳，盐析法 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同利用这一特点选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解而使杂质沉淀或者相反以达到分离目的 DNA 在NaCl溶液中的溶解度先增大后减小在DNA溶解度最低时 DNA从溶液中析出而其他杂质还留在溶液中达到粗提取的目的酶水解法采用RNase（可以买）水解杂质RNA如果混入DNase酶可以采用100度加热15min使其失活 RNase不会失活反之采用DNase可以提取RNA 混了RNase、时加入蛋白酶K或加碘乙酸钠。

用Trizol 法提取RNA什么是Trizol？Trizol 是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出核酸酶。

由于RNA酶无处不在和其难以灭活的顽固本性，RNA的抽提环境应严格控制，所用试剂耗材均应是RNase-free或经过DEPC处理过的，具体的注意事项可参见上一篇文章《分子狗，你还在谈qRT-PCR色变吗？》。

接下来我们着重从实验步骤的各个阶段进行剖析：一，样品准备①从组织中提取总RNA液氮研磨，将组织块放入研钵中，加入少量液氮，迅速使用研杵研磨，期间不断加入液氮，直到组织研磨成粉末状。

每50-100 mg组织加入 1 ml Trizol，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。

匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10%，用匀浆器充分匀浆，直到无明显颗粒，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。

②从细胞中提取总RNA贴壁细胞，去除培养基，用适量无菌PBS清洗细胞表面，加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。

悬浮细胞，收集细胞悬液，1000×g离心5 min，弃培养基；用适量无菌PBS清洗细胞，1000×g离心5 min弃上清，沉淀加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。

③从细菌中提取总RNA对于细菌或蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高的样品，需要额外的分离步骤。

加入Trizol吹打混匀后，4℃，12000×g，离心10 min。

将上清转移至新的RNase-free 的离心管中，存在-80℃冰箱备用。

二，RNA提取①将冻存的RNA样本从-80℃冰箱取出置于冰上解冻。

②于每管样本中加入200 µl RNA专用的三氯甲烷(每毫升Trizol加200 µl)，置于振荡器震荡1 min，冰上静置5 min。

你还在用30年前发明的技术提RNA吗？你还在使用Trizol法提RNA吗？天哪，不要让我为您的健康担忧！Trizol都已经要被边缘化了，别告诉我您还蒙在鼓里？Trizol试剂的主要成分是苯酚，在实验操作中还会添加氯仿等有机试剂，长期接触会对您健康造成危害，尤其是皮肤直接接触会导致严重的化学灼伤和永久性疤痕。

通常情况下实验室的小伙伴们只能通过全面武装自己来降低危害（穿实验服，戴手套和口罩）。

而我给您的建议是：请您直接换掉Trizol，从源头避免危害。

请往下看1RNA提取的第一代产品于1987年问世（Trizol类试剂）优点：提取较完整缺点：需使用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿等有毒试剂；操作繁琐；需使用DNase去除DNA污染2RNA提取的第二代产品于1994年问世（QIAGEN的RNeasy和国内大多数产品）优点：采用柱式离心法，操作简便；缺点：需要离心去组织碎片需使用DNase去除DNA污染3RNA提取的第三代产品于2005年问世（QIAGEN的RNeasy Plus和福际的RNA纯化系列产品）优点：直接采用DNA清除柱同时去除DNA和组织碎片，省时省力；安全便捷，无需添加过滤柱和DNase即可轻松去除杂质，避免DNA污染输看看QIAGEN官方公布的数据：RNeasy Plus问世以来至今已经超过1万出版物引用，每年引用量呈现直线上升趋势。

输咱们再来看RNA提取的第一代产品（Trizol）、第二代产品（RNeasy）和第三代产品（Foregene）的操作差别：图中操作一目了然：第三代产品优势明显就三个词形容：简便！快捷！安全！输RNA提取的第一代产品、第二代产品和第三代产品的实验结果PK 图：1、电泳图第一代（1：Trizol）第二代（2：QIAGEN的RNeasy ）第三代（3：QIAGEN的RNeasy plus，4：Foregene）哪种产品好，一比就知道利用福际试剂盒提取的RNA不仅浓度高同时完整性好2、qPCR图（扩增曲线图）第一代（Trizol）第二代（天蓝色QIAGEN RNeasy-，红色QIAGEN RNeasy +）第三代（蓝色表示Foregene，绿色表示QIAGEN RNeasy plus）（注：qPCR图第二代QIAGEN RNeasy-表示试剂盒未加DNase，未去除DNA的污染，因此CT较靠前，结果不准确；QIAGEN RNeasy +表示加入DNase，已去除DNA污染，结果准确）不论是电泳图还是定量PCR扩增曲线图，福际产品质量丝毫不输国外进口产品，质量杠杠哒！小编身为过来人，深知做实验的心酸，好的产品当然要和你们一起分享啦！就让福际生物帮你简化实验，轻松得到好结果，从此高分发文不是梦！选择福际让我们用卓越的品质来获得您的青睐吧！还有更多好用的产品等你来pick哟~Foregene福际生物。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理RNA（核糖核酸）在许多生物学过程中起着至关重要的作用，如基因表达调控、蛋白质合成等。

Trizol 法是一种广泛应用于提取细胞或组织中总 RNA 的方法。

下面将详细介绍 Trizol 法提取 RNA 的实验步骤及原理。

一、实验原理Trizol 试剂主要成分包括苯酚、异硫氰酸胍等。

异硫氰酸胍是一种强变性剂，能够迅速破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，并抑制RNA 酶的活性，从而保护RNA 不被降解。

苯酚则能够促使蛋白变性，并使核酸从蛋白核酸复合物中释放出来。

在 Trizol 处理样品后，RNA 会溶解在水相中。

通过加入氯仿，离心后可将溶液分为水相、有机相和中间层。

RNA 存在于水相中，而 DNA 和蛋白质分别存在于有机相和中间层。

收集水相，通过异丙醇沉淀可得到 RNA。

最后，用乙醇洗涤 RNA 沉淀以去除残留的盐和杂质，从而获得较为纯净的 RNA。

二、实验步骤1、材料准备细胞或组织样本Trizol 试剂氯仿异丙醇75%乙醇（用 DEPC 水配制）无 RNA 酶的离心管、移液器吸头离心机涡旋振荡器2、样本处理细胞样本：将培养的细胞收集到离心管中，离心弃去培养液。

加入适量的 Trizol 试剂，反复吹打使细胞充分裂解。

组织样本：将新鲜组织切成小块，放入液氮中速冻，然后研磨成粉末。

加入适量的 Trizol 试剂，充分匀浆。

3、室温静置裂解后的样本在室温下静置 5 分钟，使核蛋白体完全解离。

4、加入氯仿按每 1ml Trizol 试剂加入 02ml 氯仿的比例，剧烈振荡 15 秒，然后室温静置 2 3 分钟。

5、离心在 4℃下，以 12000g 离心 15 分钟。

离心后，溶液分为三层：上层为无色的水相，含有 RNA；中间层为白色；下层为红色的有机相，含有 DNA 和蛋白质。

6、转移水相用移液器小心地将上层水相转移到一个新的无RNA 酶的离心管中，避免吸取中间层和有机相。

TRI_(ZOL)：一种适于一步分离RNA的新试剂
王柏;秋提供
【期刊名称】《国外医学：遗传学分册》
【年(卷),期】1995(18)4
【摘要】能否在基础和临床研究的很多领域取得进展取决于能否获得高质量的RNA。

在众多分离RNA的方法中,一种建立在异硫氰酸胍/苯酚/氯仿抽提基础之上的一步RNA分离法已被广泛接受,主要由于这种方法在保证质量的同时可大幅度地减少分离RNA所需时间。

TRIZOL是RNA一步分离法改进后的方法。

TRIZOL 试剂是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液。

在样品均浆或裂解过程
中,TRIZOL试剂能保证在破坏细胞和溶解细胞成份时RNA仍保持其完整性。

加入氯仿。

【总页数】3页(P212-213)
【关键词】RNA;核糖核酸;分离法;试剂;一步分离法
【作者】王柏;秋提供
【作者单位】哈尔滨医科大学遗传教研室
【正文语种】中文
【中图分类】Q522
【相关文献】
1.一种自制的RNA分离试剂及其在鱼组织总RNA提取中的应用 [J], 徐坤;李铎;张优优;李陇平;麻丽霞;张智英
2.推荐一种既适于多种旱地作物使用又适于水稻耕种的新除草剂Saslufenacil [J], 邓金保（译）
3.TRIZOL：一种适于一步分离RNA的新试剂 [J], 无
4.一种适于生产L—苯丙氨酸的新酶—乙酰氨基苯丙烯酸酰基转移酶(acetamidocinnamate acylase)的分离及其特性 [J], W.Hummel;黄诗笺
5.一种用Tripure试剂从冻存组织分离纯化RNA的方法 [J], 曹廷兵;彭家和;巩燕;叶治家;江渝
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肌肉组织RNA提取
准备：
1、所用枪头、EP管用0.1% DEPC水浸泡过夜后高压。

2、冰盒。

研磨物品、勺子180℃6-8小时。

3、冰冻氯仿，冰冻异丙醇，冰冻75%乙醇（高压DEPC水配制），DEPC水。

4、超净台75%DEPC酒精擦干净，紫外15min。

5、打开冷冻离心机。

提取：
1、1.5mLEP管中加入1mL Trizol，插在泡沫板上，置于天平上调零。

2、取样，倒入液氮，研成粉状。

所用剪刀镊子勺子都预先置于液氮中。

每管中加50mg左右样品粉末。

3、迅速剧烈震荡2min，静置20min以充分裂解。

（样品粉末会成团，尽量摇散）
4、加200μL冰冻氯仿，剧烈震荡15s（粉红乳液），冰浴5min，分层。

5、4℃，14000rpm，15min。

取上层400μL水相于另一1.5mL EP管中。

6、加等体积冰冻异丙醇（400μL），颠倒混匀15s（透明不分层），冰浴5min。

7、4℃，13000rpm，10min，弃液。

可见白色RNA沉淀于管底。

8、1mL75%乙醇，涮洗，弃液；1mL75%乙醇，温和震荡以悬浮沉淀。

9、4℃，7500rpm，3min，弃液。

用枪头尽量吸尽液体。

干燥。

10、35μL DEPC水，轻弹溶解。

11、-80℃保存。

检测：
1.2%普通琼脂糖凝胶电泳，0.5×TBE
20mL：0.24g琼脂糖，2μL EB
上样：5μL RNA+2μL溴酚蓝，7-8min。

Trizol提取组织总RNA的方法实验原理：Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA 分离开。

水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

液氮研磨组织：实验准备：研钵、研棒、药匙清洗后高压消毒；线手套、烧杯高压消毒。

材料：1.5mlEP管，200μL EP管（RNA-Free）试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；75％乙醇（DEPC处理水：无水乙醇=1:3）；桌面清理干净，酒精擦拭消毒。

1.取出冻存于-80℃的组织，放于液氮中。

2.在研钵中导入部分液氮，对研钵、研锤进行预冷。

取出组织，放入含有液氮的研钵中，左手戴上线手套，外面套两层PE手套，扶住研钵，右手持研锤压碎组织。

Tip：为了防止组织研碎过程中蹦出，左手在刚开始研磨过程中可以护住研钵口；可以用研棒将组织聚集到一起进行研磨，这样更容易捣碎；研磨期间不断加入液氮，防止组织中RNA因温度升高降解；3.研磨完成后，将研磨好的组织粉末收集到已经编号的含有Trizol的EP管中。

如果组织较少，可以将Trizol 的量减半（500μL）。

4.接下来进行Trizol提取RNA操作Trizol 提取RNA实验准备：离心机预冷；70％乙醇预冷值-20℃。

1.将EP管上下颠倒，充分混匀，室温放置5分钟。

2.在通风橱中操作。

加入200ul（0.2倍体积）的氯仿，盖紧盖，剧烈震荡混匀15秒，室温静置5 min。

12000g，4℃离心15min。

Tip：使用1mL的枪吸取。

3.离心后溶液分为三层，RNA存在于上清中，离心管从离心机上拿下来时要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。

吸取上清的时候一定要轻，切忌吸取太多，少量即可（400-500ul），避免碰到下层沉淀。