第四章 基因克隆的载体

第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。

其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。

下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。

（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。

有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。

有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。

质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。

例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。

质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。

质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。

根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。

严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。

质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。

质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。

实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。

第四章基因克隆载体1. 定义：携带外源基因进入受体细胞的这种工具称为载体( Vector)载体的本质是DNA 。

2. 在基因工程中所用的载体，主要有5类:⑴质粒(Plasmid)⑵噬菌体 (phage)的衍生物⑶柯斯质粒(Cosmid)⑷单链DNA噬菌体M 13(5)动物病毒3. 理想的载体应具备的条件：(1) 具有自我复制能力(2) 有适宜的限制酶切位点，最好是对多种常用的限制酶有单一切点，并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上(3) 具有一个或几个选择性遗传标记(4) 分子量较小，在受体细胞内有较多的拷贝数⑸可携带足够长度的外源DNA片断，并能有效的转化至宿主细胞中(6)容易从宿主细胞中分离纯化4.1质粒载体4.1.1质粒的一般生物学特性1. 质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

它广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。

在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。

质粒分子的大小为1~200kb，它可以“友好”地“借居”在宿主细胞中，依靠宿主细胞的现有体系进行自身复制，并将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达；同时质粒也提供给宿主细胞一些抗性、免疫性。

2. 质粒的类型(1) F 质粒：又叫F 因子或性质粒(sex plasmid), F +、F -。

F + F -时，染色体标记低频转移，F 因子高频转移F 质粒可以整合到染色体上，同步复制(这种菌株在与F -菌株杂交时，比F +所产 生的遗传重组频率要高103倍)，称为Hfr 菌株(高频菌株)Hfr F -时，染色体标记高频转移，F 因子低频转移F 因子从染色体脱离下来时，往往会带有染色体片断，这种带有染色体片段的F 因子称为F'因子。

(2) R 质粒：也称抗药性因子。

R 质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此中抗性通常能转移到缺乏该质粒的受 体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

有关“基因克隆载体”的意思解释
有关“基因克隆载体”的意思解释如下：
基因克隆载体是指用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子。

基因克隆载体能够承载外源DNA片段（目的基因）并将其带入受体细胞，帮助目的基因在受体细胞中稳定遗传和表达。

基因克隆载体的基本元件包括启动子、编码区和终止子等，这些元件能够控制基因的表达。

基因克隆载体通常具有松弛的复制子，能够带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。

除了基因克隆载体，还有一种表达载体，其除了具有基因克隆载体的基本元件外，还应具有转录/翻译所必需的DNA顺序，如转录因子、转录激活蛋白等，以实现目的基因的有效转录和翻译。

简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。

常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。

根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。

质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。

2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。

病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。

3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。

人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。

4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。

原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。

第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。

它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒通称抗药性因子。

它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。

它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。

大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。

绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。

在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。

其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。

凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。

二．质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。

基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较 详尽研究的主要有质粒、质粒和 质粒。

①质粒又叫因子或性质粒（ ）m 它们能够使寄主染色体上 的基因和 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②质粒通称抗药性因子。

它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且 通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的 抗菌素抗性能力。

③ 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。

它们编码有控制大肠杆菌素合成 的基因。

大肠杆菌是一类可以使不带有 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死 的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性一、质粒细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。

绝 大多数的质粒都是由环形双组成的复制子（图 ）。

Q 大肠杆菌质粒分子的结构示意图质粒是细菌染色体外能够自我复制的环形双链的DNA 分子.编码抗菌素抗性基因的 质粒叫R 质粒，大部分质粒是可以转移的，但也存在着不能够转移的质粒 环形质粒分子 环形染色体DNA大肠杆菌细胞质粒分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形（），这样的通常呈现超螺旋的构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环（）N此即构型；3若质粒经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子l ），通称构型（见图—l。

(a) (b)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图由于琼脂糖中加有嵌入型染料漠化乙锭.因此, 在紫外线照射下DNA电泳条带呈橘黄色。

（a）道中的SC DNA走在凝胶的最前沿.OC DNA则位于凝胶的最后边Mb）道中的LDNA是经核酸内切限制醉切割质粒之后产生的.它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。