植物凝集素提取工艺

绿豆凝集素的分离提取及其部分性质研究

凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。凝集素在动、植物体内广泛存在。

凝集素具有糖基结合特异性，一种凝集素仅对某一种特定的糖基专一性结合，因此凝集素可以作为探针等研究工具，并且研究凝集素的特异性有助于以分子或原子层次了解生命现象或病理变化。本文对绿豆凝集素进行了分离提取及纯化，并对其部分基础性质进行初步研究。

绿豆凝集素的凝集活性检测采用凝血法检测，对新鲜兔血红细胞进行处理，戊二醛浓度0.15%(V/V)，固定时间为20min；胰蛋白酶浓度25U/mL，25℃处理

15min；提高了兔血红细胞凝集灵敏度且延长了兔血红细胞保存时间。绿豆凝集素的提取采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)，最佳浸提溶液条件：0.2mol/L、pH7.2PBS。

将绿豆干粒粉碎100目，以料液比0.09（浸提液为1），NaCl浓度0.3mol/L，浸提时间4.16h，20℃下浸提，所得粗提液中绿豆凝集素比活力137.4U/mg。对绿豆凝集素粗提液进行硫酸铵双重盐析，收集50%~60%饱和度沉淀，凝集素比活力达到805.9U/mg。

采用PEG600-硫酸铵双水相体系，PEG600质量分数15%，硫酸铵质量分数25%，绿豆凝集素样品浓度8mg/mL，萃取后绿豆凝集素凝血活性达到1307.8U/mg。经过葡聚糖凝胶过滤后凝集活性为1961.9U/mg。

绿豆凝集素具有较强的抗热处理能力，对酸有一定的耐受性，在低pH下依然能保持凝集活性，但是碱性条件下耐受性较差，在pH为8.11的条件下很快失活，在pH6.5~7.5之间具有最大凝集活性。绿豆凝集素SDS-PAGE电泳显示两条

wga麦胚凝集素提取方法

摘要：

1.麦胚凝集素（WGA）的基本信息

2.WGA的提取方法

3.提取过程中的注意事项

4.WGA的应用领域

5.总结

正文：

一、麦胚凝集素（WGA）的基本信息

麦胚凝集素（WGA）是一种从麦胚中提取的蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，能与含有特定糖基序列的大寡糖结合。WGA具有聚乙二醇（PEG）和凝集素两种修饰物，其分子量有2000、3400、5000等多种，其他分子量还可定制。

二、WGA的提取方法

1.原料准备：选用新鲜麦胚作为原料，去除杂质和脂肪，确保提取纯度。

2.麦胚破碎：将麦胚进行机械破碎，使其细胞破碎，释放出麦胚凝集素。

3.提取：将破碎后的麦胚加入适量的水中，搅拌均匀，进行提取。提取过程中，可采用超声波辅助提取，以提高提取效率。

4.离心：将提取液进行离心，分离出上清液和沉淀。上清液中含有WGA，可通过进一步纯化获得纯度较高的WGA。

5.纯化：采用凝胶过滤或离子交换色谱等方法对WGA进行纯化，获得高纯度的WGA。

6.浓缩：将纯化后的WGA溶液进行浓缩，以减少水分，提高产品浓度。

7.冷冻干燥：将浓缩后的WGA进行冷冻干燥，得到粉末状的WGA产品。

三、提取过程中的注意事项

1.确保原料质量：选用新鲜、优质的麦胚作为原料，避免使用发霉、变质的麦胚。

2.提取温度：控制在低温条件下进行提取，以保持WGA的活性。

3.提取时间：根据实际情况调整提取时间，避免过长或过短的提取时间影响提取效率。

4.避免氧化：提取过程中注意防止WGA氧化，可采用抗氧化剂保护WGA。

四、WGA的应用领域

植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。

（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。

（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。

青豌豆的提取：取青豌豆100克，加含0.15M氯化钠的0.01M pH7.0磷酸缓冲液200ml浸泡过夜，经膨胀后用组织捣碎机捣碎，倒入布袋中压榨出水提液，在沉渣中再力0入磷酸缓冲液100ml搅拌，浸泡1时，压榨出水提液，合并水提液，量出总体积。加0.01％叠氮钠防腐。2．蛋白质沉淀：边搅边加入固体硫酸铵达80％饱和（每升溶液加硫酸铵561克）冷藏过夜。吸取上清液，沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干，即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。置冰箱保存。3．亲和层析分离(1)装柱：取直径为1.0 cm，长度为25 cm的层析柱，按（实验十五）操作，自顶部缓缓加入稀薄的Sephadex G25悬液，待凝胶上升至距顶柱约3-5 cm即可，用1M NaCl溶液平衡10分钟。（2）加样并收集：称硫酸铵糊0.3克溶于 3 ml IM氯化钠中，离心3000rPm10分钟，取上层悬液上柱，用1M NaCl洗脱收集每管 3.5 ml，在280 nrn紫外光上比色检测，直至吸光值下降到接近零为止。此洗脱峰为不与葡萄糖亲和的杂蛋白峰。改用含0.2M葡萄糖的1M NaCl进行洗脱。收集每管 3.5 ml，也在280nrn处检测、直至吸光值下降至接近零为止。此洗脱峰为青豌豆素峰，再用1M NaCl洗脱，再生柱，约需10分钟。4．青豌豆素生物活性测定。取新鲜兔血l ml于抗凝管中，离心去除血浆，血球用生理盐水洗涤离心1000rpm／5min三次，直至洗液无血色为止，加生理盐水稀释20倍制成兔红细胞悬液，置冰箱中备用。取点滴板一块在三孔中分别滴入对照生理盐水、280 nrn吸收峰的吸光值相同的杂蛋白和青豌豆蛋白各2滴（用生理盐水将二种蛋白质稀释到吸光值相同），再分别滴入兔红细胞悬液1滴。置37℃保温10分钟，取出后分别用玻棒在孔中轻轻搅动，比较三者红细胞的凝集情况。再将杂蛋白和青豌豆素溶液进一步用生理盐水稀释成1：5、l：25、l：125、1：625……再用上述方法检查比较它们对兔红细胞的凝集作用，求出它们最大生物活性的稀释倍数。兔红细胞的凝集作用也可用显微镜下进行观察、比较。注意事项：不同蛋白质凝集活性的比较需在以相同280 nrn 吸光值的蛋白质量作对比，故必需稀释

黑木耳凝集素的提取工艺

作者：邓政东程爱芳蒲玉婷

来源：《江苏农业科学》2015年第03期

摘要：以黑木耳为原料，采用磷酸缓冲液浸提，在料液比、浸提时间、浸提温度等单因素试验的基础上，设计正交试验，以研究黑木耳凝集素的最佳提取工艺。结果表明，以磷酸盐缓冲液为提取剂，料液比1 g ∶15 mL，提取温度为 30 ℃，提取时间为16 h条件下，黑木耳凝集素的凝集活性最高，达到0.742。

关键词：黑木耳；凝集素；提取工艺；凝集活性

中图分类号： S646.601；R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0259-02

黑木耳（Auricularia auricula）营养丰富，是我国传统的食药兼用菌，含有多糖、凝集素、三萜类等药用成分，具有提高免疫功能、抗癌、降血脂等功效。随着双孢菇、灵芝、金针菇和口蘑等真菌凝集素及抗肿瘤效果的发现，真菌凝集素的作用被逐渐认识，它具有凝集细胞、活化淋巴细胞、免疫调节、抑制癌细胞、抑制植物病原真菌等作用[1-3]。我国是黑木耳的生产和消费大国，研究黑木耳中包括凝集素在内的多种活性成分的提取工艺，对黑木耳的开发和利用具有重要意义。本研究利用磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）浸提法，采用正交试验，优化提取工艺条件，以期为黑木耳凝集素在食品、医药、保健方面的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑木耳干品从市场购买，经粉碎、筛分、密封后存放于阴凉处备用。鸡血由武汉生物工程学院基础生物学实验室提供。试验所需试剂均为分析纯。

玉竹黄精凝集素的分离纯化

凝集素介绍：

凝集素是在自然界广泛存在的可以凝集细胞和使糖复合物或多糖复合物沉淀的非免疫来源的蛋白质或糖蛋白,在植物、动物和微生物体中发挥着多种重要的生物学功能。凝集素已经被应用到细胞间的相互作用,配基和受体的识别,血型的鉴定,淋巴细胞的分布,健康和病理条件下的组织化学研究,肿瘤细胞的识别,细胞的黏附和定位,生物膜信号的传导,增强肌体免疫防御,生物大分子的运输和某种程度上的免疫识别过程。

单子叶甘露糖结合凝集素作为一类研究的比较多的凝集素已在多种植物中被发现,如郁金香、芦荟、风信子等。而且单子叶甘露糖结合凝集素已经在不同领域引起了越来越多的关注,并且大部分是其抗病毒活性和抗虫特性的生物化学研究和开发。尤其是近来在免疫缺陷病毒方面的研究,使得单子叶甘露糖结合凝集素的研究意义更加突出。

玉竹凝集素的提取纯化：

实验原理：

百合科植物玉竹( Polygonat um odorat um ( Mill. ) Druce) 的根状茎经生理盐水浸取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose 柱离子交换层析和Sephacryl S-200 凝胶过滤，即可得到玉竹凝集素的纯品。

实验材料：

玉竹;

丙烯酰胺(acrylamide) ;

氯化铯(Caesium chloride);

碘化钾;

所用溶液均以双蒸水配制.

取玉竹根状茎经高速组织捣碎机粉碎,经3 倍体积生理盐水(0. 9 %NaCl) 浸取、过滤、离心(4°C ,4500r/ min ,30min) 后,向上清液中加入30 %～80 %硫酸铵进行蛋白质分级沉淀,离心收集沉淀并用水充分透析除去硫酸铵得玉竹凝集素粗品。

专利名称：一种豆类植物凝集素的提取方法专利类型：发明专利

发明人：王敏康

申请号：CN200910094233.1

申请日：20090318

公开号：CN101508730A

公开日：

20090819

专利内容由知识产权出版社提供

摘要：一种豆类植物凝集素的提取方法，属植物有用成分提取技术领域。为水提法，在40～60℃温度下提取，按以下步骤：豆类种子粉碎到40～100目→加入浸泡液在40～60℃温度下提取60～180分钟并打捞豆皮→粗分去除豆渣→离心分离得含植物凝集素的上清液→对上清液进一步进行分离纯化→浓缩或干燥得植物凝集素。可于提取的全过程或部分过程中施加超声波或微波，或交替施加超声波和微波进行辅助提取。本发明完全抛弃了传统的低温浸泡低温处理方法，实践证明是一种简单高效和短时间的提取植物凝集素的方法。通过有关检测，所得植物凝集素能满足常规的实验及药用需要。本发明克服了现有技术产品有较多化学试剂成分遗留和提取时间长的缺点。

申请人：王敏康

地址：650092 云南省昆明市一二一大街298号云南师范大学生命科学院

国籍：CN

代理机构：昆明科阳知识产权代理事务所

代理人：李行健

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第11周 2011-5-3/4

植物凝集素的分离纯化及部分性质测定

分离纯化工艺策略：

主要是根据物质的结构和性质来选用各种纯化技术。工艺次序的选择策略包括：

1.应选择不同机理的分离单元组成一套工艺；

2.应将含量多的杂质先分离出去；

3.尽早采用高效分离手段；

4.将最昂贵、最费时间的分离单元放在最后阶段。也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段主要目的是尽量缩小样本体积，提高目的物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白质类杂质）；

5.随后是高分辩率的操作单元，如具有选择性的离子交换色谱和亲和色谱，而将凝胶过滤色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以使分离效益大大提高。色谱分离的次序。一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤之间的过渡。

如：

◇在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的交换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合能力较强。

◇凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成形保存。总之，蛋白质的纯化大至步骤为：样品经初步提取筛除部分杂质后，选择不同的层析手段相互配合进一步提纯。

第一部分离子交换层析

1. 原理：

离子交换层析（Ion-exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对各类化学物质或生物大分子因电荷差异而产生不同的结合力，从而将混合物中不同组分进行分离的层析技术。

Cation exchanger（阳离子交换）: 层析介质本身带负电荷,交换带正电荷物质

科技文苑

双水相萃取法提取紫花油豆中凝集素

□鲍宗源布振钱郝晓妤吕晓萌孙靖莹东北农业大学理学院

摘要：本文建立了一种从紫花油豆中快速高效分离凝集素的方法，采用PEG-盐双水相体系进行分离，以上相蛋白得 率和纯化倍数作为评价指标，分别考察了（NH4)2S04质量分数、PEG600质量分数和体系p H值三种显著单因素，同时用 SDS-PAGE电泳对其进行检测，探究凝集素在PEG600/(NH4)2S04双水相体系中的分配规律。结果表明：双水相体系分离 凝集素的最优条件为（体系共5mL) :3mL25%(w/w)的（NH4)2S04溶液、lm L90%(w/w)的PEG600溶液、lm L的粗蛋白提取液、调p H值为7.5,此时上相蛋白得率为42.32%,纯化倍数为3.08。

关键词：紫花油豆；凝集素；双水相萃取

由于能够特异性结合单糖、多糖和 糖蛋白，植物凝集素在医学、材料科学 和农学方面览¥了巨大的作用和价值[1]。紫花油豆（菜豆）是我国东北地区分布 的一种地方性物种。其中蛋白质含量达 20%以上。这些蛋白质其合理的氨基 酸组成和较高的凝集素含量，使其具有 较高的营养价值和生物学价值。

作为传统的蛋白质分离方法，硫 酸铵沉淀法也用于提取凝集素。此方 法的缺点是它耗时长且产量低™。亲 和层析法大大提高了凝集素的产量，但其工业化成本高且难以扩大生产[3]。因此，建立一种快速、经济高效的凝 集素提取方法，以提高选择性和产量，降低成本尤为重要。

目前，双水相提取技术也被尝试用 于分离纯化凝集素。2010年，Nasd_ mento141研究了Canova&^m«7fe/w is凝 集素（ConBr)在PEG600/磷酸盐体系以及PEG600/柠檬酸钠体系中的分 配。Soares® 研究了在PEG8000/ 柠 檬酸盐体系中，从Canavaft_am«ybmis 种子的粗提取物中提取和纯化ConcanavalinA(ConA)〇Nascimento161采用PEG8000/柠檬酸钠体系从

植物凝集素-是从植物中萃取的一种糖蛋白和蛋白质的混合物，因可引起红细胞凝集而得名

植物凝集素-是从植物中萃取的一种糖蛋白和蛋白质的混合物，因可引起红细胞凝集而得名。虽然不同种类植物凝集素中糖蛋白和蛋白质的混合比例不同，但是它们的生物学作用相近。

学术术语来源---

植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖及分泌因子表达的变化

文章亮点：

1 植物凝集素是常用的分裂原，但是植物凝集素对细胞凋亡作用的研究较少。文章结果显示外周血单个核细胞在植物凝集素刺激下，增殖指标上升的同时蛋白水解酶3表达上升，提示细胞凋亡增加。

2 外周血单个核细胞主要是免疫细胞，也可从中分离培养内皮细胞。植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖的同时，会促进其活化，但对内皮细胞的作用报道较少。文章创新性的检测了内皮分泌因子的变化，发现体外培养和植物凝集素的加入会影响内皮分泌因子表达，提示植物凝集素对内皮细胞的生物学活性存在影响。

3 全血培养和外周血单个核细胞分离培养存在差异，提示全血中非外周血单个核细胞物质对体外培养和植物凝集素的作用存在一定影响。

关键词：

干细胞；培养；植物凝集素；外周血单个核细胞；细胞因子；细胞增殖；细胞凋亡；炎症因子；内皮分泌因子；全血培养；体外培养；荧光定量RT-PCR；国家自然科学基金

主题词：

干细胞；植物凝集素类；细胞因子类；细胞增殖；细胞凋亡

摘要

背景：植物凝集素可以刺激外周血单个核细胞分裂并引起免疫细胞的活化，是常用的细胞增殖模型。但是全血中的非外周血单个核细胞成分(血浆和无核细胞)在植物凝集素参与的体外培养过程中起到什么作用，以及内皮分泌因子的表达情况尚不明确。

植物凝集素凝集原理

一、识别机制

植物凝集素（lectin）是一类具有特异糖结合活性的蛋白质。它们能够识别并特异性地结合糖蛋白或糖脂中的糖链，通常是通过与糖的特定结构域相互作用。这种识别机制主要依赖于凝集素分子中的特定氨基酸序列，这些序列能够与特定的糖结构形成互补。这种互补性使得凝集素能够精确地识别并结合细胞表面的糖链，从而在细胞间或细胞与外界物质间形成特定的相互作用。

二、共价交联

植物凝集素在识别并结合糖链后，可以通过共价交联的方式将细胞或细胞器连接在一起。这种交联作用可以发生在细胞表面、细胞内部或细胞间的连接处。共价交联的形成是由于凝集素能够与糖链上的特定化学基团发生反应，从而形成不可逆的化学键。这种交联作用在植物的生长发育和生理过程中具有重要的作用，如参与细胞的粘附、形态发生和组织分化等。

三、诱导细胞反应

植物凝集素在与细胞表面的糖链结合后，可以诱导一系列的细胞反应。这些反应可以是生理性的，也可以是病理性的。例如，某些植物凝集素可以诱导细胞凋亡，而另一些则可以促进细胞的生长和分裂。这些反应的发生通常是基于凝集素对细胞表面糖链的识别和交联作用，并通过信号转导途径介导的。了解这些反应有助于我们深入探究植物的生长和发育机制，并为未来的生物技术应用提供理论基础。

四、生物防御

植物凝集素在生物防御方面也起着重要的作用。许多植物中的凝集素具有抗菌、抗病毒和抗虫的活性，能够识别并清除进入植物体内的病原体和寄生虫。这些凝集素可以通过与病原微生物表面的糖蛋白或糖脂结合，阻止其入侵和增殖。同时，凝集素还能够激活植物自身的免疫反应，诱导植物合成更多的抗菌物质，从而提高其抵抗疾病的能力。了解植物凝集素的生物防御机制对于植物病理学、农业生产和农作物育种等领域具有重要意义。

专利名称：一种提取植物凝集素的方法

专利类型：发明专利

发明人：梁永波,陈玲,李莉,刘玲玲,齐华,马锦华,耿伟,杨晓华申请号：CN201910695519.9

申请日：20190730

公开号：CN110283242A

公开日：

20190927

专利内容由知识产权出版社提供

摘要：本发明涉及一种提取植物凝集素的方法，属于植物凝集素提取技术领域。本发明中通过缓冲液浸泡、酸调沉淀蛋白和加0.1‑0.4%的氯化钠溶液沉淀蛋白三个步骤就能够将植物凝集素从豆子中提取出来，提取方法简单、方便；而且提取过程中使用的试剂便宜、易得，对人体无危害。并且，提取的PHA蛋白纯度高、活性好，将提取出的PHA蛋白应用于淋巴细胞培养基中，无凝血和溶血现象，刺激淋巴细胞生长效果良好。本发明中的提取方法适合于大规模的生产PHA蛋白。

申请人：河南赛诺特生物技术有限公司

地址：450001 河南省郑州市高新技术产业开发区翠竹街1号109号

国籍：CN

代理机构：郑州睿信知识产权代理有限公司

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植物提取工艺流程

《植物提取工艺流程》

植物提取是从植物中提取有效成分的过程，是药物、食品、化妆品等行业的重要生产工艺之一。植物提取工艺流程可以分为原料准备、提取、浓缩、分离和干燥等环节。

首先是原料准备。植物提取的第一步就是准备好所需的原料，通常是选用新鲜的植物材料，也可以使用植物的种子、根、叶、果实等部分。对于一些需要特殊处理的植物材料，还需要进行粉碎、破碎或浸泡等处理。

接着是提取。提取是将植物中的有效成分与植物的其他成分分离出来的过程。常用的提取方法包括水提取、乙醇提取、超临界流体提取等。在提取过程中，需要根据植物材料的性质和要提取的成分特点选择合适的提取方法。

然后是浓缩。浓缩是将提取得到的液体溶液中的溶剂去除，得到所需的浓缩液。通常采用蒸发、冷冻浓缩、真空浓缩等方法进行浓缩处理。浓缩后的液体通常含有更高浓度的有效成分。

紧接着是分离。分离是指将浓缩后的液体中的各种成分进行分离，得到需要的目标成分。常用的分离方法包括凝集、过滤、结晶、离心、萃取等。

最后是干燥。植物提取得到的目标成分通常是一种液体或半固态状态，需要通过干燥处理得到固体产品。通常采用喷雾干燥、

真空干燥、减压干燥等方法进行干燥处理。

通过以上工艺流程，植物提取得到的成分可以更方便地用于药物、食品、化妆品等行业的生产中，带动了相关产业的发展和创新。同时，不断改进提取工艺流程，可以提高生产效率，降低生产成本，也有助于提升提取产品的品质和安全性。