8微生物的菌种诱变

微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。

这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。

二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。

诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。

化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。

这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。

三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。

为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。

这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。

同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。

四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。

遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。

这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。

五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。

生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。

这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。

1 菌种选育目的生产，科研2 自然变异的自然选育。

诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程技术育种。

3 菌种的选育包括选种和育种5自然选育是一种纯种选育的方法8诱变育种理论基础：基因突变(诱发突变)9诱发突变A诱变剂的种类①物理诱变剂紫外线、X-射线、γ-射线，快中子②化学诱变剂碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍，甲基磺酸乙酯等。

比物理诱变电离辐射有效，经济，是致癌剂，危害大。

用杀菌率诱变剂量。

杀菌率=（m―n）/m ×100％m：未被处理菌体长出的菌落数n：被处理菌体长出的菌落数达到一定后剂量↗诱变率↘。

近来倾于杀菌率为70-80％的剂量，优良突变菌株筛选直接摇瓶筛选法和琼脂柱预筛选法初筛：筛出大量达初步要求菌落，以量为主。

复筛：精选，以质为主，以精确度为主。

12 突变株的筛选（Selection）1] 摇瓶筛选法2] 琼脂块筛选法3] 自动化筛选a1营养缺陷型突变株的富集培养方法1：抗生素富集法方法2：过滤法a2营养缺陷型的检出方法1.逐个检出法：方法2.影印法：具体操作误差较大。

方法3.夹层法：14 杂交育种使用的培养基完全培养基（CM）基本培养基（MM）有限培养基（LM）补充培养基（SM）：15杂交方法(1)混合培养法(2) 平板杂交法(3) 玻璃纸转移法20保藏目的：不死亡，不生长，不污染，不降低或不丧失其优良性，以尽量延长使用时间原理：休眠21常用保藏法1.斜面低温保藏法4C˚冰箱2、液体石蜡保藏法3. 沙土管保藏法4.甘油管保藏法 5.冷冻保藏冷冻保藏（-20℃以下）：保藏菌种最简单有效方法，加入保护剂（甘油或二甲基亚砜）冷冻，代谢停止。

温度愈低，效果愈好。

6.冻干保藏冷冻保护剂，用脱脂乳和蔗糖，国外用动物血清。

27国外主要的保藏机构有：1. ATCC美国标准菌种收藏所各种菌种一万种以上。

2. CSH冷泉港研究室美国。

3. IAM 日本东京大学应用微生物研究所。

微生物的化学诱变化学诱变：利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。

化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。

复合处理及其协同效应：诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对育种很有意义。

复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用。

定向培育和驯化：定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。

由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。

微生物化学诱变的操作过程化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。

化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，移取液体时绝对禁止直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防止污染环境，造成公害。

一、碱基类似物用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5-IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。

最常用是5-BU和AP。

当将这类物质加入到培养基中，在繁殖过程中可以掺入到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。

它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺入诱变剂。

显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。

（一）碱基类似物的诱变机制正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。

5-BU导致A:T碱基对转换为G:C碱基。

2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A:T－G:C或G:C－A:T的转换。

（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）1．单独处理将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8~10 h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25~40 μg/mL，温合均匀，取0.1~0.2 mL菌悬液加入到琼脂培养基上涂布培养。

微生物菌种选育方式(一)关键词：地衣芽孢杆菌诺卡氏菌 ATCC 北京标准物质网微生物菌种选育技术在现代生物技术中具有十分重要的地位，经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种五个阶段，各个阶段并不孤立存在，而是相互交叉，相互联系的。

新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展。

1．自然选育随着微生物学的发展，特别是在发明微生物的纯培养技术之后，出现了微生物纯种的自然选育。

以基因自发突变为基础选育优良性状菌株的这种方法，是最早应用微生物遗传学原理．进行育种实践的一个实例。

由于微生物体内存在光复活、切补修复、重组修复、紧急呼救修复等修复机制以及DNA聚合酶的校正作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10-10这样低的突变率导致自然选育耗时长、工作量大，影响了育种工作效率。

在这种情况下，就出现了诱变育种技术。

2．诱变育种1927年，Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。

之后，人们发现其他一些因素也能诱发基因突变，并逐渐弄清了一些诱变发生的机理，为工业微生物诱变育种提供了前提条件。

1941年，Beadle 和 Tatum 采用X射线和紫外线诱变红色面包霉，得到了各种代谢障碍的突变株。

在这之后，诱变育种得到了极大发展。

诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种诱变方法。

诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。

其中，物理诱变剂包括紫外线、X射线、射线、快中子等；化学诱变剂包括烷化剂(如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等)、天然碱基类似物、脱氨剂(如亚硝酸)、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类(如氯化锂及硫酸锰等)；生物诱变剂包括噬菌体等。

物理诱变剂因其价格经济，操作方便，所以应用最为广泛；化学诱变剂多是致癌剂，对人体及环境均有危害，使用时须谨慎；生物诱变剂应用面窄，其应用也受到限制。

现今，诱变育种已取得了显著的成果，如青霉素生产菌的青霉素产量在40年内增加了近万倍，达到lO万u／ml左右；谷氨酸产生菌经紫外诱变处理，产酸率提高了3l％；用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌，使其从原来的以玉米粉为碳源转变为以大米为碳源进行发酵产酶，后用紫外诱变，最终筛选出F一8014菌株，产酶量提高了37％。

原核细胞型微生物1. 菌落：单细胞接种到固体培养基形成的一个肉眼可见的细胞群体。

2.荚膜：某些细菌在一定营养条件下可向细胞壁表面分泌一层松散透明，粘度极大的胶状物质。

3.鞭毛：起源于细胞质膜内侧的基粒，穿过细胞壁而生出于菌体外的纤细、弯曲、能收缩的丝状物。

4.芽孢：有许多细菌发育到某个阶段，在细胞内形成一个圆形或椭圆形的，对不良环境条件具有抗性的特殊结构称为芽孢，又称内生孢子。

5. 质粒：细菌细胞中尚存有染色体外的遗传因子。

为分子量较小的环状DNA分子，能自我复制。

6. 菌胶团：多个细菌的荚膜连在一起的，其中包含着许多细菌。

7.微荚膜：有些细菌的荚膜很薄（20nm）就称为微荚膜。

8. 微生物：肉眼看不见的，必须借助于显微镜才能看见的微小生物。

9. 微生物学：是研究微生物生命活动规律的学科。

10、蓝细菌：是一类进化历史悠久、无鞭毛、含叶绿素a、进行产氧性光合作用的大型的原核生物。

真核细胞型微生物1. 子实体：大型真菌的产孢结构。

2. 同宗接合：接合发生在相同类型的菌丝细胞之间。

3. 异宗接合：接合发生在不相同类型的菌丝细胞之间。

4. 初生菌丝：由担孢子萌发形成的单核菌丝。

5. 次生菌丝：性别不同的两条初生菌丝结合形成的双核菌丝。

6. 有隔菌丝：菌丝管腔中有横隔膜。

7. 无隔菌丝：菌丝管腔中无横隔膜、为一个细胞，内有多个核。

8. 假菌丝：有些酵母菌的芽体成熟后并不脱离母体细胞，而是在成熟的芽体上进一步出芽，形成藕节状的细胞连接体，期间以狭小的面积相连，称之为假菌丝。

9. 吸器：有些寄生性真菌的菌丝在侵入寄主细胞后形成的伸入细胞吸收营养的旁支10. 菌核：高等真菌菌丝形成的抵抗不良环境的颗粒休眠体11. 菌索：菌丝平行排列形成的绳索状结构12. 假根：根霉属真菌的匍匐丝与基质接触分化形成的固着和吸收作用的根状菌丝非细胞型微生物1. 噬菌斑：指在细菌培养平板上接种噬菌体后，出现的透明的溶菌空斑。

2. 噬菌体：侵染细菌的病毒。

微生物诱变育种的方法摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。

关键词:诱变; 微生物育种微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。

微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。

作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。

目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。

1 物理诱变紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。

DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。

紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚体[1]。

二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。

马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高%，较出发菌株提高了68%。

顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、L，分别比原始菌株提高了%、%。

紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。

电离辐射γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。

其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。

其间接效应是能使水或有机分子产生自由基，这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致DNA分缺失和损伤[2]。

实验八硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应（一）目的要求通过实验观察硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌的诱变效应。

初步掌握化学诱变育种的方法。

（二）基本原理许多化学因素如硫酸二乙酯、亚硝酸等，对微生物都有诱变作用。

硫酸二乙酯是一种烷化剂，能与DNA中碱基发生化学变化，从而引起DNA复制时碱基配对的转换或颠换。

一般化学诱变剂都有毒性，很多还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取，并防止与皮肤直接接触。

中止反应时，可以用大量稀释法或加入硫代硫酸钠。

本实验以产生蛋白酶的枯草芽孢杆菌为实验菌种，以硫酸二乙酯为诱变剂，根据枯草芽孢杆菌诱变后在培养基上出现的透明圈直径大小，来指示诱变效应。

（三）实验材料1. 菌种酶泥（菌悬液）2. 培养基肉膏蛋白胨培养基＋0.5％可溶性淀粉（牛肉膏0.5%，蛋白胨1％，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%，pH7.0－7.2）。

3. 主要药品硫酸二乙酯(简写DES，(C2H5)2SO4)、25％硫代硫酸钠。

4. 器皿试管、移液管、锥形瓶、培养皿、离心管、玻璃涂棒、量筒、烧杯等。

（四）实验步骤1. 诱变前的准备工作1）菌种斜面的活化从冰箱取一支纯化后的枯草芽孢杆菌1.398斜面接种到新鲜肉膏蛋白胨斜面培养基上，置于30℃温箱培养24h进行活化。

2）枯草芽孢杆菌对数期培养液的制备取一环已活化的枯草芽孢杆菌接种到装有30 ml肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶内(每组同学2瓶)，在30℃振荡培养16h，此时为该菌的对数期。

3）准备平板将装在锥形瓶内已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷至45℃左右倾注10个平板待用。

4）菌悬液的制备取上述对数期的枯草芽孢杆菌培养液10 m1，3000 r/min 离心15 min ，沉淀下的菌体用10 ml 0.1mo/LpH 7.0的磷酸缓冲液洗涤两次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。

2. 硫酸二乙酯诱变处理 1）诱变吸取1 ml 菌悬液至盛有8ml 无菌水的试管内，再加硫酸二乙酯0.5 ml ，振荡处理5 min 。

单项选择题1.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：识记下列选项中不属于微生物基因突变的特性的是 ( )。

选项A）自发性选项B）非相应性选项C）稀有性选项D）不可逆性答案：D2.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：识记基因突变的种类有很多，下面有哪一项不属于基因突变 ( )。

选项A）营养缺陷选项B）抗性突变选项C）产量突变选项D）饰边答案：D3.知识点：1(微生物的突变) 难易度：较难认知度：认知不能在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型为（）。

选项A）野生型选项B）营养缺陷型选项C）条件致死突变型选项D）R因子答案：B4.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：认知营养缺陷型菌株是指 ( )。

选项A）有营养不良症的菌株选项B）培养基中缺少某种成分才干生长良好的菌株选项C）培养基中营养成分缺少时获得的菌株选项D）丧失了合成某种营养成分能力的菌株答案：D5.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：认知已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，经突变改变为CAACATCAT：该突变属于（）选项A）缺失选项B）插入选项C）颠换选项D）转换答案：D6.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：认知已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，经突变改变为CATACATCAT：该突变属于（）选项A）缺失选项B）插入选项C）颠换选项D）转换答案：B7.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：认知切除修复过程的酶为（）选项A）核酸内切酶和核酸外切酶选项B）核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶选项C）核酸外切酶和DNA连接酶选项D）阻遏蛋白酶、核酸内切酶、核酸外切酶和DNA连接酶答案：B8.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：认知SOS过程涉及到基因是（）选项A）recA选项B）nosZ选项C）nirS选项D）nifH答案：A9.知识点：1(微生物的突变) 难易度：容易认知度：认知下列属于染色体畸变的是（）选项A）染色体缺失选项B）染色体置换选项C）染色体转换选项D）染色体颠换答案：A10.知识点：1(微生物的突变) 难易度：适中认知度：应用筛选细菌营养缺陷型时，为了提高筛选工作效率，经常在培养基中加入一定量的青霉素，以浓缩营养缺陷型，这一实验所用的培养基必须是 ( )。

微生物菌种诱变筛选方法及其应用许翠;高梦祥【摘要】野生微生物菌株的代谢产物的产量通常很低，不能满足工业生产的需求，因此简单高效、定向稳定的微生物菌种诱变技术和快速、有效的高通量筛选方法在微生物菌种选育中显得至关重要。

综述了近年来国内外微生物菌种诱变筛选领域出现的新技术和新方法，可为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供参考。

【期刊名称】《长江大学学报（自科版）农学卷》【年(卷),期】2013(000)012【总页数】5页(P56-60)【关键词】微生物;菌种;诱变;筛选【作者】许翠;高梦祥【作者单位】长江大学生命科学学院，湖北荆州434025;长江大学生命科学学院，湖北荆州434025【正文语种】中文【中图分类】Q933微生物具有独特和高效的生物转化能力，能产生多种代谢产物，其产物中的一些生物活性物质（如抗生素、氨基酸、糖肽等）在医药、食品和化工工业中有着不可取代的地位［1］。

然而，通常从自然界分离得到的野生菌株代谢产物产量往往很低，远不能满足工业生产的需要，因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改良，以获得高产高效的优良工业菌株。

而微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向加以引导，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种［2］，以降低生产成本［3］。

微生物诱变处理一般采取物理诱变方法，如紫外线（UV）、X射线等和化学诱变方法如碱基类似物、烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）等传统方法。

但是，这些方法具有耗时、费力、工作量大以及诱变结果不具定向性等缺点。

随着生命科学技术的发展以及学科交叉的深入，基因工程、原生质体融合和生物信息学等的应用日益广泛，使得菌种改良技术得到了不断的发展和创新，从而为筛选得到更多优质、高效菌种提供了技术上的可能和便利［4］。

为此，笔者综述了近年来国内外出现的微生物菌种诱变新技术以及新的筛选方法在微生物菌株选育中的应用，旨在为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供启迪和参考。

第八章微生物遗传变异与菌种选育习题及答案第八章《微生物遗传与菌种选育》习题及参考答案一、名词解释1．点突变：DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变，称为点突变。

2．感受态：受体菌最易接受到外源DNA片段并实现转化的生理状态。

3．基因工程：又称重组DNA技术，它是根据人们的需要在体外将供体生物控制某种遗传性状的一段生物大分子-----DNA切割后，同载体连接，然后导入受体生物细胞中进行复制、表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

4．接合：遗传物质通过细胞间的直接接触从一个细胞转入到另一细胞而表达的过程称为接合。

5．F'菌株：当Hfr菌株内的F因子不正常切割而脱离其染色体时，可形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，含有这种F因子的菌株称为F'菌株。

6．诱变育种：使用各种物理或化学因子处理微生物细胞，提高突变率，从中挑选出少数符合育种目的的突变株。

7．营养缺陷型：由于基因突变引起菌株在一些营养物质（如氨基酸、维生素和碱基）的合成能力上出现缺陷，而必须在基本培养基中添加相应的物质才能正常生长的突变型。

野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。

原养型：一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。

9．重组DNA技术：是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物或新物种的一种崭新的育种技术。

10．基因重组：或称遗传重组，两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。

11．基因突变（genemutation）和移码突变：基因突变（genemutation）：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，而导致的遗传变化就称基因突变。

移码突变：指诱变剂会使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。