CHO细胞的稳定转染与基因表达
1、pcDNA3.1＋-gD的线性化:pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡMfeⅡBst 1107ⅠEam1105ⅠPvuⅠScaⅠSspⅠ),通过DNAMAN分析gD序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。
2、转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞,加入5ml培养基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。
3、通过分光光度计测定pcDNA3.1＋-gD的浓度,用不含血清、抗生素、蛋白质的培养基稀释2.5ug的pc DNA3.1＋-gD至总体积150ul，其最小浓度不低于0.1ug/ul,稀释后应颠倒几次EP管以混匀混合物。
4、向混匀的混合物中加入15ul转染试剂(PolyFect Transfection Reagent QIAGEN),用加样器吹打5次。
6、在室温下(20-25℃)孵育混合物5-10分钟。
7、在孵育的同时，吸出dish中的培养基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的培养基(含血清，不含抗生素)。
8、孵育完成后加入1ml培养基(含血清),用加样器吹打2次，将产物全部加入60mm的dish中，轻轻摇动dish以混匀。
9、37℃,5%CO2培养，在细胞汇合度不超过50%时加入G418进行筛选。
转染时转染两组细胞，组一在转染后细胞汇合度不超过50%时（一般是24小时）加入G418进行筛选；组二在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种于dish中，48小时后加G418筛选。
10、加入G418后，每3天更换一次含有筛选浓度的G418。当有大量细胞死亡（5-7天）时，可以把G4 18的浓度减半维持筛选（此时可以加入适应性培养基1：4来改善细胞对培养基的同化作用）。
11、筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后，制备细胞悬液，记数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入48孔板中增殖（为了减少实验失误带来的风险建议冻存部分增殖细胞）。
12、细胞大量扩增后，提取总DNA，做PCR检测目的基因是否存在。
CHO细胞的稳定转染与基因表达 1、pcDNA3.1＋-gD的线性化:pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡMfeⅡBst 1107ⅠEam1105ⅠPvuⅠScaⅠSspⅠ),通过DNAMAN分析gD序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。 2、转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞,加入5ml培养基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。 3、通过分光光度计测定pcDNA3.1＋-gD的浓度,用不含血清、抗生素、蛋白质的培养基稀释2.5ug的pc DNA3.1＋-gD至总体积150ul，其最小浓度不低于0.1ug/ul,稀释后应颠倒几次EP管以混匀混合物。 4、向混匀的混合物中加入15ul转染试剂(PolyFect Transfection Reagent QIAGEN),用加样器吹打5次。 6、在室温下(20-25℃)孵育混合物5-10分钟。 7、在孵育的同时，吸出dish中的培养基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的培养基(含血清，不含抗生素)。 8、孵育完成后加入1ml培养基(含血清),用加样器吹打2次，将产物全部加入60mm的dish中，轻轻摇动dish以混匀。 9、37℃,5%CO2培养，在细胞汇合度不超过50%时加入G418进行筛选。 转染时转染两组细胞，组一在转染后细胞汇合度不超过50%时（一般是24小时）加入G418进行筛选；组二在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种于dish中，48小时后加G418筛选。 10、加入G418后，每3天更换一次含有筛选浓度的G418。当有大量细胞死亡（5-7天）时，可以把G4 18的浓度减半维持筛选（此时可以加入适应性培养基1：4来改善细胞对培养基的同化作用）。 11、筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后，制备细胞悬液，记数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入48孔板中增殖（为了减少实验失误带来的风险建议冻存部分增殖细胞）。 12、细胞大量扩增后，提取总DNA，做PCR检测目的基因是否存在。
cho细胞表达系统及筛选原理 Cho细胞表达系统及筛选原理 一、引言 Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。 二、Cho细胞表达系统的原理 Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。 1. 转染 将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。 2. 选择性筛选 为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。 3. 扩增和表达 经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模
蛋白质表达。通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。 4. 蛋白质纯化 经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。 三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用 Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。 1. 高表达水平 Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。 2. 真核细胞表达 与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。 3. 可选择性筛选 通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。 4. 灵活性
1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO 表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？ 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：
C H O细胞表达系统常 见问题及解析 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
1、问：请问有人养过CHO细胞吗文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞cho细胞转染效率高吗 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有： （1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长
CHO细胞转染 CM=MEM+HT+FBS SM=MEM+FBS TM =MEM+HT HT 是次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷混合剂，由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。 FBS 胎牛血清含有维持细胞生长的激素，基础培养基中没有的少量营养物；提供结合蛋白；解毒；贴壁细胞生长所需因子来源；缓冲系统；提供蛋白酶抑制剂。 1 初筛先用TM培养到6H（不含血清，因为转染所用是脂质体转染，其中阳离子脂质体其主要作用，将DNA包裹其中，血清中存在缓冲液系统，破坏转染），换用CM，因为是贴壁细胞，要用还有血清培养液；另外还有有HT才能正常生存。24H换CM到48H （6-48h，一方面，转染主要有瞬时转染和稳定转染，在这个时间，瞬时转染基本消失，只剩下稳定转染；另一方面，转染成功细胞蛋白的表达时间），胰酶消化，用10倍胰酶的SM 中止——此时若DHFR基因已经成功转染，则可以在不含有HT的培养液中生存，即起一个筛选作用。同时可以认为与其连锁的目的基因也成功转染到宿主细胞。接下来再用G418进行筛选，NEO也是一个与目的基因连锁的基因，但是与DHFR结合在不同质粒上。如果成功转染，则可以在含有G418的培养液中生存。 2 复筛用MTX筛选。 而通过目的基因与dhfr基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物MTX所抑制，在MTX浓度选择压力下，dhfr基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与dhfr基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着dhfr基因的扩增而扩增，我们就得到了能大量表达外源蛋白的细胞克隆，这在基因工程抗体及各种基因工程蛋白的表达中是可行度很高的一种措施。 分析在初筛中，单独使用SM可以筛选出还有DHFR和目的基因的细胞；单独使用G418可以筛选出还有Neo和目的基因的细胞；而同时使用，则需要两种基因和目的基因都转染的细胞。
cho培养基开发意义 一、背景介绍 随着生物科技的发展，CHO（中国仓鼠卵巢）细胞已成为生物制药、基因工程等领域的重要研究对象。CHO培养基的开发对于推动我国生物制品产业的发展具有重要意义。 二、CHO培养基的开发意义 1.生物制药领域的应用 CHO细胞具有较高的蛋白质表达水平，已成为许多生物制药产品（如抗体药物、细胞因子等）的生产宿主细胞。CHO培养基的开发为这些药物的大规模、低成本生产提供了可能。 2.基因工程领域的应用 CHO细胞易于转染和基因编辑，使其成为基因工程研究的重要模型细胞。CHO培养基的研发有助于实现基因的高效表达和功能研究。 3.疫苗研发中的应用 CHO细胞低免疫原性使其成为疫苗生产和研发的理想细胞系。CHO培养基的开发有助于推动我国疫苗产业的进步。 4.生物制品大规模生产的支持 CHO细胞稳定的细胞株系为生物制品的大规模生产提供了有力保障。CHO培养基的研发为我国生物制品产业的国际竞争力提供了技术支撑。 三、CHO细胞培养技术的优势 1.高表达特性：CHO细胞具有较高的蛋白质表达水平，有利于生物制品的
生产。 2.易于转染和基因编辑：CHO细胞转染效率较高，便于进行基因编辑和基因表达研究。 3.低免疫原性：CHO细胞低免疫原性降低了疫苗等生物制品的应用风险。 4.稳定的细胞株系：CHO细胞易于建立稳定的细胞株，为生物制品的规模化生产提供稳定来源。 四、CHO培养基开发的发展趋势 1.定制化培养基的发展：根据不同细胞株和生产需求，研发定制化的CHO 培养基。 2.培养基成分的优化：优化培养基成分，提高细胞生长速度和蛋白质表达水平。 3.高效生物反应器的研究与应用：研究高效生物反应器，实现大规模、低成本的生物制品生产。 五、我国在CHO培养基开发方面的进展 1.产业政策的扶持：政府加大对生物制品产业的支持力度，推动CHO培养基研发。 2.研发团队的建立与壮大：我国已组建了专业的CHO培养基研发团队，为产业发展提供技术支持。 3.国际合作与交流：积极参与国际学术交流，引进国外先进技术，提高我国CHO培养基研发水平。 4.成果转化与产业化的推进：推动CHO培养基研究成果的转化与应用，助力我国生物制品产业的发展。
cho细胞优化蛋白表达的方式 Cho细胞是一种常用的宿主细胞，被广泛应用于蛋白表达领域。Cho细胞优化蛋白表达的方式主要包括以下几个方面：选择适当的表达载体、优化启动子和信号序列、调节培养条件、选择合适的转染方法以及利用辅助蛋白等。 在Cho细胞中进行蛋白表达，需要选择适当的表达载体。常见的表达载体包括质粒和病毒载体。质粒载体通常用于转染Cho细胞，而病毒载体则可以通过感染Cho细胞来实现蛋白表达。根据实验的需要，可以选择不同类型的载体，如pCDNA3.1、pLVX等。 优化启动子和信号序列也是提高蛋白表达效率的重要策略。启动子是控制基因转录的序列，在Cho细胞中常用的启动子有CMV、EF1α等。信号序列则是控制蛋白质转运和分泌的序列，可以选择合适的信号序列来提高蛋白表达的效率。 调节培养条件也是优化蛋白表达的重要手段之一。Cho细胞的培养条件包括培养基的选择、培养温度、CO2浓度、培养时间等。合理调节这些条件可以促进细胞的生长和蛋白表达。此外，添加适当的营养物质和辅助因子，如氨基酸、维生素和抗生素等，也能提高蛋白表达的效率。 选择合适的转染方法也是Cho细胞优化蛋白表达的重要环节。常用的转染方法包括瞬时转染和稳定转染。瞬时转染通过将表达载体导
入Cho细胞，使细胞在一段时间内表达目标蛋白。稳定转染则是将表达载体导入Cho细胞，并筛选出稳定表达目标蛋白的细胞株。选择适当的转染方法可以提高蛋白表达的稳定性和效率。 利用辅助蛋白也是优化蛋白表达的一种策略。辅助蛋白可以提高蛋白质的折叠和稳定性，从而增加蛋白表达的效率。常见的辅助蛋白包括分泌辅助蛋白、折叠辅助蛋白等。在表达目标蛋白时，可以选择适当的辅助蛋白来提高表达效果。 Cho细胞优化蛋白表达的方式主要包括选择适当的表达载体、优化启动子和信号序列、调节培养条件、选择合适的转染方法以及利用辅助蛋白等。通过这些方式的综合应用，可以提高Cho细胞中蛋白表达的效率和稳定性，为后续的蛋白研究和应用奠定基础。
一文搞定CHO稳转细胞株构建 随着生物技术的迅猛发展,全球化资源整合为生物制药行业提供了越来越全面的技术支撑,抗体药物的发展也获得越来越多的重视。抗体药物开发是一个非常繁杂的过程,而稳定细胞株适用于抗体药开发的各个阶段,如重组蛋白和抗体生产、检测分析、功能性研究等等。构建适用于工业生产的高表达细胞株是第一步也是关键步骤之一。 普健生物在重组蛋白表达、抗体生产及稳转细胞株构建等方面有着10余年经验。今天小普与大家分享一种基于CHO细胞株构建的高效抗体药开发策略,能显著提高细胞株开发效率,实现高效、稳定的细胞株开发。 CHO表达系统 哺乳动物细胞是用于生产单抗在内的商业化治疗性蛋白产品的主要宿主细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞,因为与其他系统相比,CHO细胞具有以下优点： ①CHO 细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能,因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白； ②CHO 细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强,可根据培养要求选择贴壁培养或悬浮培养的方式； ③整合外源基因后的细胞稳定,重组基因能高效扩增和表达； ④表达目的蛋白可由细胞内运输到细胞外,并且CHO 细胞只表达少量的内源蛋白,有利于目的蛋白的提取。 GS筛选系统原理
哺乳动物细胞的培养生长过程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺，哺乳动物细胞通过这一酶促反应获得谷氨酰胺。 CHO细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比较低,需要在培养基中额外添加外源谷氨酰胺才能促进细胞生长。利用GS抑制剂,L-氨基亚砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制内源性GS活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体,转染宿主CHO细胞,通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增,只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培养基中生长,从而筛选获得重组表达细胞株。 筛选策略 01 宿主细胞选择 工业上主要使用两大类CHO细胞： ①G S野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza); ②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。 02 细胞株筛选 细胞转染是将外源分子(如DNA,RNA)导入真核细胞，细胞株筛选方案包括一系列步骤： 01重组载体构建 选择适合的信号肽，对抗体重轻链基因进行密码子优化。将目的基因构建到普健专有的GS载体上。 转染及Minipools筛选02 使用普健生物专利的CHO细胞转染方法进行转染。转染48h后,加压筛选Minipools。利用ELISA或Octet进行初筛，选取最优的30
1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？ 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有： （1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长
参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。 4、问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1，没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问：有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野生型CHO细胞又是指的哪种？这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？ 如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？ 参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。 （1）野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１
pcDNA3.1＋-gD稳定转染CHO细胞 1 pcDNA3.1＋-gD的线性化: pcDNA3.1＋使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡ MfeⅡ Bst1107ⅠEam1105Ⅰ PvuⅠ ScaⅠ SspⅠ),通过DNAMAN分析gD 序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。 2 转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞,加入5ml培养基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。 3 通过分光光度计测定pcDNA3.1＋-gD的浓度,用不含血清、抗生素、蛋白质的培养基稀释2.5ug的pcDNA3.1＋-gD至总体积150ul，其最小浓度不低于0.1ug/ul,稀释后应颠倒几次EP管以混匀混合物。 4 向混匀的混合物中加入15ul转染试剂(PolyFect Transfection Reagent QIAGEN),用加样器吹打5次。 6 在室温下(20-25℃)孵育混合物5-10分钟。 7 在孵育的同时，吸出dish中的培养基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的培养基(含血清，不含抗生素).
8 孵育完成后加入1ml培养基(含血清),用加样器吹打2次，将产物全部加入60mm的dish中，轻轻摇动dish 以混匀。 9 37℃,5%CO2培养，在细胞汇合度不超过50%时加入G418进行筛选。 ★转染时转染两组细胞，组一在转染后细胞汇合度不超过50%时（一般是24小时）加入G418进行筛选；组二在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种于dish中，48小时后加G418筛选。 10 加入G418后，每3天更换一次含有筛选浓度的G418。当有大量细胞死亡（5-7天）时，可以把G418的浓度减半维持筛选（此时可以加入适应性培养基1：4来改善细胞对培养基的同化作用）。 11 筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后，制备细胞悬液，记数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入48孔板中增殖（为了减少实验失误带来的风险建议冻存部分增
CHO细胞基本知识 引言 CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种常见的哺乳动物细胞系，常被用于生物技术领域的研究和应用。CHO 细胞具有诸多优点，如易于培养、较高的复制速度和稳定性等，使其成为生物药物生产的重要工具。本文将介绍CHO细胞的 基本知识，包括其来源、特点、培养条件和应用等方面。 来源 CHO细胞最初来源于中国仓鼠卵巢组织，1957年被美国科学家狄利克(Dilworth)和哈普斯特(Hamster)首次成功培养。 经过多年的研究和改进，CHO细胞逐渐成为工业界主要采用 的细胞系之一。现在，CHO细胞已经被广泛应用于生物制药 行业，特别是重组蛋白的生产。 特点 CHO细胞有许多特点使其成为生物药物生产的理想细胞系。
1.易于培养：CHO细胞相对容易培养，可以在常规的 培养基中生长。其生长要求较为简单，包括适当的培养基、温度、pH值、营养物质等。 2.高繁殖速度：CHO细胞的繁殖速度较快，在适宜的 培养条件下，细胞数量可以迅速增加。这对于大规模的生 物药物生产非常有利。 3.稳定性：CHO细胞在长期培养过程中具有较高的遗 传和表达稳定性。这对于生物药物的一致性和稳定性非常 重要。 4.多样性：CHO细胞可以表达多种重组蛋白，包括抗 体、生长因子、酶等。这使得CHO细胞在生物制药领域有广泛的应用前景。 培养条件 CHO细胞的培养条件对于细胞的生长和表达产物的质量具 有重要影响。以下是一些常用的培养条件： 1.培养基：CHO细胞通常使用含有葡萄糖和氨基酸的 培养基，如DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi um）或RPMI 1640。培养基中还可以添加胎牛血清（FBS）或
1、问：请问有人养过CHO®胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是 高糖还是低糖？ 参考见解：CH&田胞用高糖DME养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有： （1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2）WESTERN-BLO可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先 要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长参
考见解：培养CHO B胞最好用F12,并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子, 因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单 细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CH（细田胞。无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone 就有）；第二种方法实际上是有血清培养,只不过血清浓度很低罢了,可以近似的认为无血清。在第二种方法里,又可以分出两条途径：你可以分步进 行，也可以一步到位。分步法是，CHC细田胞先在含10%血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养,再到含 2.5 ％血清的培养基里培养,依此类推,培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。 4、问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插 入pcDNA3.1,没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CH&田胞。就相关问题想问问：有的文献上没有署名K1或是DHFR普通所写的CH&田胞是指那种？野生型CH（细胞又是指的哪种？这三种细胞是不是因为CHO-K和CHO/DHFR-扩增基因GS和DHFR可以更为有效的扩增进而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？ 如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFRg加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接 转染？而转染CHO-DHF需要和携带DHFR的标记质粒共转染？ 参考见解：做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一 个抗性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目 的蛋白也得到了有效的表达。 (1) 野生型CHO就是CHO —K1
CHO表达系统 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO 表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游
构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？ 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。 2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？ 参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：（1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。 （2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。 （3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。 当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！ 3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长 参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血
cho细胞表达 Cho细胞表达是指在生物学中，利用Cho细胞（Chinese Hamster Ovary cells）作为表达系统来表达外源蛋白质的过程。Cho细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有较高的蛋白质表达能力和稳定的遗传特性，因此被广泛应用于生物医学研究和制药工业中。 Cho细胞表达系统的优势在于其能够高效地表达外源蛋白质，并能够正确地折叠和修饰蛋白质。Cho细胞具有相对简单的遗传背景和较低的背景蛋白质表达，可以避免其他细胞系统中常见的问题，如蛋白质聚集、不稳定、部分折叠等。此外，Cho细胞的培养和维持相对容易，生长速度快，适应不同的培养条件，对不同的基因表达系统都具有较高的兼容性。 Cho细胞表达系统的应用范围广泛，包括生物医学研究、药物发现与研发、生物制药等领域。在生物医学研究中，Cho细胞表达系统常被用于产生重组蛋白，如抗体、细胞因子、酶等，用于研究蛋白质功能、结构与机制。在药物发现与研发中，Cho细胞表达系统被用于产生药物靶标蛋白、药物载体、药物代谢酶等，用于筛选和评价药物候选化合物。在生物制药中，Cho细胞表达系统常被用于大规模生产重组蛋白药物，如单克隆抗体、重组蛋白等。 Cho细胞表达系统的建立和优化需要考虑多个因素。首先，选择合
适的载体和表达系统是关键。常用的载体包括质粒、病毒载体等，表达系统可以是稳定转染系统或转染后选择稳定表达细胞的系统。其次，选择合适的表达宿主细胞株和培养条件也十分重要。Cho细胞的培养基和培养条件需要根据表达蛋白的特性和需求进行优化，包括培养基成分、温度、pH值、培养密度等。此外，还需考虑到蛋白质折叠、修饰和纯化等后续步骤。 Cho细胞表达系统的优势也存在一些限制和挑战。首先，Cho细胞是一种非人类细胞，因此相较于人类细胞，其表达的蛋白质可能存在差异。其次，Cho细胞在遗传稳定性和蛋白质表达水平上存在一定的变异性，需要进行筛选和优化。此外，Cho细胞的培养和维持相对费时费力，对于大规模的生产需求可能不太适用。 Cho细胞表达系统是一种常用且有效的表达外源蛋白质的系统。其优势在于高效、稳定地表达蛋白质，并能够正确折叠和修饰蛋白质。Cho细胞表达系统在生物医学研究和制药工业中有着广泛的应用前景。但在应用过程中，需要综合考虑多个因素，并在实验中进行优化和验证，以获得最佳的表达效果。
cho细胞传代步骤 全文共四篇示例，供读者参考 第一篇示例： Cho细胞是一种来源于中国仓鼠的动物细胞，通常被用于生物学 研究和药物生产中。传代是指将细胞培养物中已有的细胞进行细胞分裂，从而增加细胞数量的过程。Cho细胞的传代步骤比较繁琐，需要 严格控制培养条件和操作方法。下面将介绍Cho细胞传代的具体步骤和注意事项。 第一步：选择适当的培养基 Cho细胞的培养基是维持细胞生长和增殖的重要条件。一般来说，选用较适合Cho细胞生长的培养基如DMEM/F12或者RPMI-1640，并添加适当的胎牛血清、抗生素和营养物质。 第二步：细胞分离 在传代之前，需要将Cho细胞从培养瓶中分离出来。用PBS等缓冲液冲洗细胞，然后使用胰酶等消化酶将细胞从基质中分离出来。注 意要控制消化酶的浓度和作用时间，以免对细胞造成伤害。 第三步：计数和接种
接下来需要将分离出的Cho细胞进行计数，通常使用血细胞计数板或细胞计数仪来进行。根据实验需要和细胞密度的要求，确定接种 的细胞数量和密度。 第四步：培养 将计数好的Cho细胞接种到新的培养瓶中，培养条件要保持恒定，包括温度、CO2浓度、湿度等。培养过程中需要定期观察细胞生长情况，及时更换培养基和处理细胞。 第五步：细胞增殖和传代 在细胞培养达到一定密度时，可以进行传代操作。将细胞用PBS 冲洗一次，然后用消化酶进行消化，将细胞分离出来。接着进行细胞 计数并接种到新的培养瓶中。 第六步：细胞保存 如果需要长期保存Cho细胞，可以使用液氮或者-80℃冰箱进行冷冻保存。在保存过程中要注意细胞冻存液的成分和贮存条件，以保证 细胞的良好状态。 传代过程中需要注意的事项： 1. 保持无菌操作，避免细菌和真菌的污染。 2. 严格控制消化酶的作用时间和浓度，以免对细胞造成损伤。 3. 定期检测细胞的纯度和活性，防止细胞老化或变异。