乌骨藤多糖脱蛋白工艺的研究
目的优选乌骨藤多糖脱蛋白工艺。方法以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，考察酶-Sevage法对乌骨藤多糖脱蛋白的效果。结果酶-Sevage法的蛋白脱除率分别为75.09%，多糖保留率分别为89.83%。结论酶-Sevage法脱蛋白的方法可行。
标签：乌骨藤；多糖；脱蛋白
乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤茎，主产于云南、贵州，始载于《滇南本草》[1]。乌骨藤味苦，性微寒，具有清热解毒、止咳平喘、抗癌等功效，用于咽喉肿痛、肺热咳喘和疮痈癌肿，以乌骨藤制成的片剂和注射剂广泛用于治疗肝癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤[2]，其抗肿瘤效果显著。前期实验证实，乌骨藤多糖具有抗肿瘤活性[3]，但有关其多糖的研究报道较少。为了对乌骨藤多糖的结构、空间螺旋构型及抗肿瘤活性进一步研究，本文对水提醇沉法制得多糖中含有的蛋白进行了分离，对其脱蛋白工艺进行了研究，选用酶-Sevage法脱蛋白，兼顾考虑蛋白脱除率和多糖保留率，优化乌骨藤粗多糖脱蛋白方法，有关乌骨藤多糖脱蛋白的研究尚未见文献报道。
1 材料
乌骨藤购于安国杏林药材公司，经本校药学院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为萝藦科植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的藤茎，保存于辽宁中医药大学标本馆中。
紫外分光光度计（UV-1800型）；离心机（TDL-5-A）；
电子天平（上海天平仪器厂）；pH计；牛血清白蛋白（北京奥博星生物技术责任有限公司130225）；考马斯亮蓝G-250（国药集团化学试剂有限公司）；木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司，6×106U/g）；葡萄糖；重精馏苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯。
2 方法
2.1 乌骨藤多糖的提取[4]
取乌骨藤药材250g，加6倍量95%乙醇回流提取2次，每次1h，过滤，药渣挥干乙醇后加8倍量水100℃提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入95%乙醇使乙醇体积分数达到80%，静置过夜，抽滤，沉淀用有机溶剂洗涤，干燥得乌骨藤粗多糖。
2.2 乌骨藤多糖的含量测定[5]
2.2.1 葡萄糖标准溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10.12mg，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得到葡萄糖标准溶液。
2.2.2 标准曲线的制备精密量取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL置于10mL具塞试管中，加蒸馏水补足至2mL，分别加入5%苯酚液1.0mL，充分摇匀，再加入浓硫酸5.0mL，摇匀，置于40℃水浴中反应15min，冷却至室温，490nm处测吸光度（A），另取蒸馏水2mL按上述显色方法作为空白，以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖浓度（C）为横坐标，得回归方程：A=0.0608C-0.1281，r=0.9996。
2.2.3 样品中多糖的含量测定精密吸取样品溶液2.0mL，按“2.2.2”项下显色方法进行操作，分别测定吸光度，计算样品中多糖含量和多糖保留率，多糖保留率=脱蛋白后的多糖含量/脱蛋白前的多糖含量×100%。
2.3 乌骨藤多糖中蛋白质的含量测定[6]
2.3.1 蛋白质标准溶液的制备精密称取牛血清蛋白10.04mg，置于100mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得到蛋白质标准溶液。
2.3.2 标准曲线的制备精密吸取蛋白标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于10mL的具塞试管中，分别加入考马斯亮蓝染液5mL，加蒸馏水补足至6mL，摇匀，放置30min，另取蒸馏水1mL按上述方法做空白，595nm处测定吸光度（A），以吸光度（A）为纵坐标，牛血清蛋白浓度（C）为横坐标，得回归方程：A=0.0347C+0.02，r=0.9992。
2.3.3 样品中蛋白质的含量测定精密吸取样品溶液1.0mL，按“2.3.2”项下显色方法进行操作，分别测定吸光度，计算样品中蛋白质的含量和蛋白质脱除率，蛋白脱除率=（脱蛋白前蛋白质含量- 脱蛋白后蛋白质含量）/脱蛋白前蛋白质含量×100%。
2.4 酶-Sevage法脱蛋白方法考察[7]
精确配制0.02g/mL的乌骨藤多糖溶液100mL，加入木瓜蛋白酶2g，摇匀，调节多糖溶液的pH值使pH=7，恒温水浴40℃酶解1h，酶解结束后沸水浴10min 灭活木瓜蛋白酶，离心除去变性蛋白沉淀，取上清液进行Sevage法脱蛋白，重复10次，测定蛋白脱除率和多糖保留率。
3 结果
3.1 结果分析
采用酶法脱蛋白后联合Sevage法脱蛋白，分析所得蛋白脱除率和多糖保留率，以Sevage法脱蛋白次数为横坐标，分别以蛋白脱除率和多糖保留率为纵坐
标绘图，结果见图1。
由图1分析可知，酶法脱蛋白后采用Sevage法脱蛋白5次蛋白脱除率为77.65%，脱蛋白10次的蛋白脱除率为78.85%，表明脱蛋白5次后蛋白脱除率的变化不明显，但多糖保留率逐渐下降，由图分析选择脱蛋白3次为最佳工艺，蛋白脱除率为75.09%，多糖保留率为89.83%。
3.2 方法验证
精确配制0.02g/mL的乌骨藤多糖溶液3份，每份100mL，分别加入木瓜蛋白酶2g，摇匀，调节多糖溶液的pH值使pH=7，恒温水浴40℃酶解1h，酶解结束后沸水浴10min灭活木瓜蛋白酶，离心除去变性蛋白沉淀，取上清液进行Sevage法脱蛋白3次，测定脱蛋白后多糖溶液中的蛋白脱除率和多糖保留率，结果见表1。4 讨论
乌骨藤多糖脱蛋白的目的在于为乌骨藤多糖的分离纯化及相关后续研究提供实验依据，故脱蛋白过程要兼顾考虑在多糖损失较少的条件下尽可能多的脱除蛋白质。目前脱蛋白可采用酶法、Sevage法、三氯乙酸法和联合脱蛋白[8]。酶法脱蛋白条件最温和，因为酶的专属性和特异性较强，只针对蛋白质进行酶促水解，低温水浴使多糖的损失较少，但需要调低参与酶法脱蛋白的溶液浓度，使酶解反应完全，反应成本较高；Sevage法脱蛋白反应较温和，利用蛋白质遇有机试剂变性的原理，操作多次才能脱除大部分蛋白质，脱蛋白次数越多多糖损失也越大；三氯乙酸法可在较少次数中脱除较多蛋白质，操作步骤简化，但其反应过于剧烈会导致多糖结构发生变化影响结构研究。
本实验采用酶法和Sevage法联合脱蛋白，本人曾对酶法脱蛋白工艺进行研究，通过四因素三水平正交试验对加酶量（1.5%、2.0%、2.5%）、pH值（5、6、7）、酶解温度（40℃、50℃、60℃）及时间（1h、2h、3h）因素进行考察，采用综合加权评分法分析结果显示加酶量与酶解时间对酶法脱蛋白有显著性影响，确定酶法脱蛋白工艺为酶用量2%，pH 7，40℃酶解1h，温度太高会导致酶活性降低，同时温度过高会使多糖水解降低多糖保留率，酶解时间过长也会增加多糖的损失。酶法和Sevage法联合脱蛋白的优点在于，酶法脱蛋白会使多糖溶液中的游离蛋白和糖蛋白分解成分子量较小的多肽或氨基酸，经过醇沉，多糖会变成沉淀，而分子量小的部分则被保留在溶液中，再经过数次Sevage法可大大提高蛋白脱除率。
本人曾对单独采用Sevage法脱蛋白工艺进行考察[9]，其最佳方法蛋白脱除率为58.75%，多糖保留率为77.16%；单独采用酶法脱蛋白[10]，最佳方法蛋白脱除率为62.82%，多糖保留率为97.65%；酶法与Sevage法联合使用蛋白脱除率为75.09%，多糖保留率为89.83%。实验结果表明酶-Sevage法脱蛋白既能脱除大部分蛋白质，且多糖保留率也较高，经验证该方法较稳定，是可行性较强的乌骨藤多糖脱蛋白方法。
[参考文献]
