实验五 拟南芥TDNA插入突变纯合体的鉴定 ppt课件
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拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
2020/12/27
1
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突
变体的方法。
2020/12/27
2
T-DNA插入鉴定的原理
2020/12/27
3
突变体鉴定的步骤
1. T-DNA插入基因的基因组序列； 2. T-DNA插入方向的确定； 3. T-DNA插入位置的确定； 4. 引物设计； 5. PCR扩增； 6. 电泳检测。
用无菌水补足体积。
2020/12/27
15
PCR反应条件
94℃ 3min 30循环 （94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）； 72℃ 延伸10min。
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整。
2020/12/27
16
PCR安排
每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自
件下，离心5分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀； （7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。
（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）
2020/12/27
14
PCR鉴定
30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L）
3 ml 10×扩增缓冲液
3 ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10mmol/L）
0.5 ml dNTP（10mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10mmol/L）
2020/12/27
4
T-DNA插入基因的基因组序列
2020/12/27
5
点击基因编号进入网页
2020/12/27
6
点击sequence viewer进入
2020/12/27
7
点击nucleotide view进入
2020/12/27
8
点击突变体编号后进入的网页
2020/12/27
9
进入网站 查找基因突变体及插入方向
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
2ml 植物基因组DNA样品（WT） 2ml 植物基因组DNA样品（111）
3ml 10×扩增缓冲液
3ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基
因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。
2020/12/27
17
046号突变体的鉴定（1-6组）
30ml反应体系1：
30ml反应体系3：
2 ml 植物基因组DNA样品（WT）
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
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10
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11
实验设计
T-DNA方向
3’引物
基因方向
5’引物
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12
引物设计
• 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥 网站进行自动生成，也可以根据自己的需要进行 设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位 置300bp以上为宜，即300+N bp。
30ml反应体系1： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml LBa 引物（10 mmol/L）
2020/12/27
1ml LBa 引物（10 mmol/L）19
Fra Baidu bibliotek
电泳检测
• 每个大组选两个人点样，电泳结果扫描保 存，下次课看结果。
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20
• LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
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植物基因组DNA的快速提取
（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加 入400 ml提取缓冲液；
（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟； （4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
2 ml 植物基因组DNA样品WT
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
3 ml 10×扩增缓冲液
3 ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10 mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10 mmol/L）
1 ml LBa 引物（10 mmol/L）
1 ml LBa 引物（10 mmol/L）
2020/12/27
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135号突变体的鉴定（7-11组）
2020/12/27
1
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突
变体的方法。
2020/12/27
2
T-DNA插入鉴定的原理
2020/12/27
3
突变体鉴定的步骤
1. T-DNA插入基因的基因组序列； 2. T-DNA插入方向的确定； 3. T-DNA插入位置的确定； 4. 引物设计； 5. PCR扩增； 6. 电泳检测。
用无菌水补足体积。
2020/12/27
15
PCR反应条件
94℃ 3min 30循环 （94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）； 72℃ 延伸10min。
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整。
2020/12/27
16
PCR安排
每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自
件下，离心5分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀； （7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。
（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）
2020/12/27
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PCR鉴定
30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L）
3 ml 10×扩增缓冲液
3 ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10mmol/L）
0.5 ml dNTP（10mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10mmol/L）
2020/12/27
4
T-DNA插入基因的基因组序列
2020/12/27
5
点击基因编号进入网页
2020/12/27
6
点击sequence viewer进入
2020/12/27
7
点击nucleotide view进入
2020/12/27
8
点击突变体编号后进入的网页
2020/12/27
9
进入网站 查找基因突变体及插入方向
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
2ml 植物基因组DNA样品（WT） 2ml 植物基因组DNA样品（111）
3ml 10×扩增缓冲液
3ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。 2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基
因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。
2020/12/27
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046号突变体的鉴定（1-6组）
30ml反应体系1：
30ml反应体系3：
2 ml 植物基因组DNA样品（WT）
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
2020/12/27
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实验设计
T-DNA方向
3’引物
基因方向
5’引物
2020/12/27
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引物设计
• 基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥 网站进行自动生成，也可以根据自己的需要进行 设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位 置300bp以上为宜，即300+N bp。
30ml反应体系1： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10×扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5’引物（10 mmol/L） 1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml 135 3’引物（10 mmol/L）
1ml LBa 引物（10 mmol/L）
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1ml LBa 引物（10 mmol/L）19
Fra Baidu bibliotek
电泳检测
• 每个大组选两个人点样，电泳结果扫描保 存，下次课看结果。
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• LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
2020/12/27
13
植物基因组DNA的快速提取
（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加 入400 ml提取缓冲液；
（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟； （4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
1 ml 0463’引物（10mmol/L）
30ml反应体系2：
30ml反应体系4：
2 ml 植物基因组DNA样品WT
2 ml 植物基因组DNA样品（111）
3 ml 10×扩增缓冲液
3 ml 10×扩增缓冲液
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml Taqase （5U/ml）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
0.5 ml dNTP（10 mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10 mmol/L）
1 ml 046 5’引物（10 mmol/L）
1 ml LBa 引物（10 mmol/L）
1 ml LBa 引物（10 mmol/L）
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135号突变体的鉴定（7-11组）