cDNA编码区片段的PCR扩增
50ul ×2
模版 1
5‘引物 1
3‘引物 1
dNTP 1
10×buffer 5
Taq 1
Milliq H2O 40
2.PCR产物纯化
加5倍体积的PB
将Spin柱放于2ml收集管上
加样液,14Krpm,离心1min
弃去排出液
加0.75ml PE, 14Krpm,离心1min
弃去排出液,14Krpm,离心1min
将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm,离心1min
3.双酶切
载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切(反应体系均为30ul,37℃,酶切n小时):
4.双酶切后的载体用试剂盒割胶回收
割胶并称重,加3倍体积的QG(胶块每100mg约合100μl的体积)
50℃,恒温10min,等到胶完全被溶解
将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中
加样液,14Krpm,离心1min
弃去排出液
加0.75ml PE, 14Krpm,离心1min
弃去排出液,14Krpm,离心1min
将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm,离心1min
5.连接
上述双酶切产物经过纯化(其中载体酶切产物割胶回收,PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同),在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下:
载体2ul
PCR 片段6ul
10xT4 buffer 1ul
T4 DNA ligase 1ul
转化
取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中,冰浴30分钟,42℃热激2min,置冰上5min,加入1mlLB培养液37℃摇床45min,离心5000rpm,1-5min(不要离心太久,以免太实),最后均匀涂布在含有100 ng/ml抗生素的LB平板上(100-150 ul)。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上,并对之进行编号,37℃倒置培养过夜。
7.菌落原位PCR
挑取转划后长出的阳性克隆菌落,加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR 模板,其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。
8. QIAGEN试剂盒抽提质粒
1用1.5ml管离心收集细菌,两次,共3ml左右。
2加入250ul的预冷的P1,打匀后在震荡仪上高速震荡1min。
3加入250ul P2,温和颠倒数次混匀。
3(在5min内)加入冰上预冷的溶液N3 350ul,迅速温和颠倒混匀,至出现分散的絮状沉淀。
4冰上静置2min后离心,13,000rpm,10min。
5小心吸取上清于蓝色的spin柱中(勿吸到沉淀)
6离心13,000rpm,1min,弃流出液
7加入750ul PE,离心13,000rpm,1min,弃流出液
8再离心一次,离心13,000rpm,1min,弃流出液。以让管内彻底干燥。
9将spin柱拿出,置于一干净的1.5ml管中,小心的在spin柱中央加入30ul MilliQ H2O,或者Elution Buffer,室温静置2min。
10离心13,000rpm,1min,收集质粒,测浓度,电泳检测。