RAW2647小鼠巨噬细胞protocol

鼠源巨噬细胞RAW264.7中TNF-α 基因的克隆及酶切鉴定赵义龙;黄金凤;赵金香;矫继峰【摘要】TNF-α 能诱导单核巨噬细胞系统的前体细胞分化,是机体非特异性免疫检测中指示性细胞因子.本研究根据Genbank NM-013693上登录的小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)序列对经过氨基多糖纳米微粒处理过的小鼠RAW264.7细胞进行RNA的提取,且RT-PCR扩增TNF-α 基因.将此片段克隆到PUCm-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定、酶切鉴定分析验证,证实所克隆序列为TNF-α 基因.序列分析表明,该基因与Genbank中发表序列的同源性达到100%.【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2017(042)003【总页数】3页(P42-44)【关键词】RAW264.7;TNF-α;PCR;克隆;酶切鉴定;序列分析【作者】赵义龙;黄金凤;赵金香;矫继峰【作者单位】新疆农业职业技术学院新疆昌吉 831100;新疆五家渠鑫宝农业科技开发有限公司新疆五家渠 831300;营口理工学院辽宁营口 115014;营口理工学院辽宁营口 115014【正文语种】中文【中图分类】Q78（1.新疆农业职业技术学院新疆昌吉 831100；2.新疆五家渠鑫宝农业科技开发有限公司新疆五家渠 831300；3.营口理工学院辽宁营口 115014）肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor;TNF）是一种糖蛋白，以两种形式存在，即TNF-α和TNF-β。

TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生，但也可以由T细胞、B细胞、NK细胞和成纤维细胞产生，其包括可溶性的TNF-α和膜相关的TNF-α两种形式[1]。

TNF-α以一种细胞与细胞接触的方式发挥细胞免疫作用，TNF-α可促使某些细胞表达MHCⅠ类分子、细胞间黏附分子，协同IFN-γ诱导MHCⅡ类分子的表达。

启动T细胞介导的细胞免疫，增强T细胞（尤其CTL）、NK细胞、淋巴因子激活性杀伤细胞(LAK)的细胞毒活性[2-3]。

RAW264.7细胞使用说明书细胞基本信息产品货号YC-C020细胞名称RAW264.7中文名称小鼠单核巨噬细胞白血病细胞细胞形态单核细胞样/巨噬细胞样，贴壁细胞传代比例1:3~1:690%DMEM+10%FBS培养体系源井细胞培养未加双抗，客户可视实际情况选择添加。

冻存液体系50%DMEM+40%FBS+10%DMSO特殊备注无细胞接收1)冻存细胞：如果是干冰运输的冻存细胞，收到后请立即转入液氮储存或短暂（24H)放至-80℃冰箱保存，或直接进行细胞复苏。

2)活细胞：如果是T25瓶活细胞运输，收到后用75%的酒精对T25瓶外表面进行消毒，之后放在5%CO2、37℃的细胞培养箱静置2h，静置后取出细胞瓶在显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞汇合度，分别在200X和40X下各拍2个不同视野的细胞拍照记录。

如果汇合度达到80%以上的传代密度，可以进行传代操作，如果细胞汇合度没有达80%以上不够传代，可以将细胞瓶内的培养基吸出在50ml离心管中并标记该细胞专用培养基后备用，保留8-10ml继续培养至可传代。

注意：收到细胞后，活细胞首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否漏液、浑浊等现象。

冻存细胞若发现干冰已挥发完、冻存管瓶盖脱落、破损等异常情况，请务必拍照保留，并于收货24h内与我们联系（电话：400-688-9033；https://）。

细胞复苏1)准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置数分钟让残余液氮挥发；2)在超净台内用吸管吸取6-7mL完全培养液至15mL离心管中；3)将细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；4)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干。

用单道移液器将所有融化的细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，1100rpm室温离心4分钟收集细胞；5)超净台内小心吸弃上清，用单道移液器吸取1mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有4mL完全培养液的T25cm2培养瓶中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。

现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine Vol.12NO.22AUG.2012·技术与方法·小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结*方瑶毛旭虎△(第三军医大学医学检验系临床微生物教研室重庆400038)摘要：RAW264.7细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，是研究微生物学、免疫学的常用细胞株。

很多研究者发现这种细胞形态极不稳定，细胞状态的评价也很困难。

本文作者结合RAW264.7培养经历及文献资料探讨RAW264.7细胞培养的经验教训和评价细胞状态的方法，旨在为培养该细胞的科研工作者提供一定的借鉴。

关键词：小鼠巨噬细胞RAW264.7（TIB-71）；细胞培养；细胞形态中图分类号：Q95-3，Q813文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2012）22-4358-02Culture Skill and Experience of RAW264.7*FANG Yao,MAO Xu-hu △(Department of Clinical Microbiology and Immunity,the Third Military Medical University,Chongqing,400038,China)ABSTRACT:RAW264.7has doughty capability of adhesion and antigen phagocytosis,so it is commonly used in microbiology and immunology.However,many researchers find that the cell is very unstable because of its morphous variation,and it is difficult to value its state.In this paper we mainly discussed the skills and experience in culturing RAW264.7and method of evaluating cell state.We hope to provide some references to researchers who would culture such cell line.Key words:Mice macrophages;RAW264.7(TIB-71);Cell culture;Cell morpha Chinese Library Classification(CLC):Q95-3,Q813Document code:A Article ID:1673-6273（2012）22-4358-02*基金项目：国家重大科技专项（2008ZXJ09014-007）作者简介：方瑶（1987-），男，硕士，主要研究方向：病原与宿主相互作用，E-mail ：lolfang@ △通讯作者：毛旭虎，E-mail ：mxh95xy@ （收稿日期：2011-11-23接受日期：2011-12-18)RAW264.7是由Abelson 鼠白血病病毒诱导BALB/c 小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株（ATCC Number:TIB-71）。

RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)1.背景知识RAW264.7中文全名为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，来源于雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤，是常用的炎症细胞模型之一，常见于研究细胞吞噬、细胞免疫、分子免疫学。

RAW 264.7 是一种单核细胞/巨噬细胞系，具有松散贴壁的立方形或纺锤形细胞和圆形活细胞。

细胞松散附着、堆积并变圆是正常的，尤其是在培养密集时。

活细胞可以分离和漂浮，特别是当培养物变得更加融合时。

这些未附着的细胞仍然有活力，应通过温和离心保留下来，然后重新加入烧瓶中。

不同批次血清的细微差异会导致 RAW 264.7 细胞或多或少的附着。

使用未经热灭活的优质血清，因为热灭活可以减少附着因子和生长因子。

2.RAW264.7细胞培养基本信息细胞照片注意要点（1）在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。

随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。

细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中，镜下观察会发现悬浮和贴壁的细胞会同时出现。

（2）该细胞传代时不需要用胰酶消化，胰酶会刺激分化。

传代时使用移液枪轻微吹打细胞使细胞脱落，贴壁牢固的细胞舍弃。

（3）该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或者立方形。

当细胞密度较大时，细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一起，有些细胞甚至脱落漂浮。

这些漂浮的细胞是存活的，在传代时应收集起来，离心后细胞沉淀可以继续培养。

（4）血清质量差异可能引起细胞贴壁能力变化，应选用高质量的胎牛血清。

超过3天不传代细胞容易分化；在细胞培养过程中，细胞吞噬抗原过多、培养条件恶劣或传代后细胞稀疏等情况，都会使细胞呈现出梭形、长梭形的形态，消化难度增加；培养时，存在少量分化细胞，属于正常现象，当贴壁细胞的比例高于20%，说明细胞生长环境有异常，需排查培养箱设置、培养基成分，以及培养器皿是否异常。

（5）若需控制细胞的分化，RAW264.7使用吹打传代，能更好地控制细胞分化率。

小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结引言：巨噬细胞是免疫系统中重要的成分，广泛存在于骨髓、血液、淋巴组织等处。

巨噬细胞具有特殊的吞噬能力，能够吞噬病原菌及其代谢产物，调控免疫反应和清除废物，对维持人体内环境稳定起着重要作用。

因此，很多研究都需要使用巨噬细胞进行相关实验，本文将介绍一种常用的实验动物模型小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结。

一、材料和试剂1. 培养基：DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）。

2. 补充剂：10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），1%青霉素-链霉素溶液。

3. 漂洗液：DPBS（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）。

4. 消化液：0.25%胰酶溶液。

5. 凝胶：1%琼脂糖凝胶。

6. 染色剂：Trypan Blue。

二、培养条件1. 温度：37℃。

2. 湿度：95%。

3. CO2浓度：5%。

三、培养步骤1. 培养皿的处理将培养皿倒置放在培养柜中，加入少量95%酒精进行消毒，再倒置晾干入培养箱。

2. 细胞传代1) 将细胞培养液放入离心管中，500g离心5分钟，倒掉上清液。

2) 加入适量的DPBS定量漂洗。

3) 加入适量的0.25%胰酶溶液，室温静置10分钟，观察细胞的脱落程度。

4) 加入适量的DMEM高糖培养基，将细胞悬浮液用吸管吸取到离心管中。

5) 500g离心5分钟，倒掉上清液。

6) 加入适量的DMEM高糖培养基进行细胞计数。

3. 细胞接种1) 取出一支分装好的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞冻存管，迅速放入37℃的水中解冻。

2) 将细胞悬浮液滴加入新培养皿中，加入足够的DMEM高糖培养基使细胞浓度达到合适的浓度（一般为10万/mL）。

3) 等待24-48小时，观察细胞生长情况，细胞覆盖率达到80%以上即可进行下一步实验。

刚好我最近也在养这个细胞，试着做下解答。

根据ATCC的介绍，这个细胞是贴壁生长的（我观察觉得是半贴壁的），传代的时候不要用胰酶消化，而是直接用细胞刮刀刮下，然后吹散成单个细胞即可。

以下是ATCC的详细说明，希望能对你的细胞培养有所帮助。

Propagation: ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%Temperature: 37.0°CSubculturing: Protocol: Subcultures are prepared by scraping.For a 75 cm2 flask, remove all but 10 ml culture medium (adjust amount accordingly for other culture vessels). Dislodge cells from the flask substrate with a cell scraper; aspirate and add appropriate aliquots of the cell suspension into new culture vessels. Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:6 is recommendedMedium Renewal: Replace or add medium every 2 to 3 days。

ＲAW２６4、７细胞株得相关信息ATCC：美国模式培养物集存库(Aｍｅrican tｙｐe ｃulｔure cｏllｅcｔion)得简写收到冷冻管细胞得处理方式1、收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形, 若有请立即通知。

细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后，移到液氮)。

2、收到T25 flask细胞得处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡,Ｔ２5 fｌasｋ均加满培养基。

２、1、检查flａsk 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况与有无污染现象,若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

２、２、将原封之Ｔ25 fｌask 静置于３７℃, 5% CO２培养箱中,使细胞回温至３7℃，并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长.２、3、隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，（取出之培养基可以再使用）,仅留约5—10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。

ＲAW2６4、7细胞株得ＣelｌCuｌｔure一、RAW２64、7细胞培养得特点1、RＡW2６4、7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时，可呈多突形。

细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。

贴壁特别牢固。

２、RＡW264、7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。

细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来.用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形，并且不能回复,这就是培养这种细胞时最需要注意得问题。

４、对于ＲAW264、7细胞她得声场时喜欢结伴。

正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接，等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层。

基因编辑RAW264.7细胞系——助力炎症以及破骨细胞生成相关研究小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）被认为是巨噬细胞的最佳模型之一，因为该细胞能够进行胞饮和吞噬作用，在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究应用广泛。

RAW264.7细胞在体外可以对刺激产生反应，并随后产生具有破骨细胞完全分化的特征的多核细胞，被广泛用于研究骨骼疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症、骨质溶解、牙周炎等。

RAW 264.7细胞系的应用：RAW264.7是单核细胞/巨噬细胞样细胞系，源自BALB/c 微小核糖核酸的Abelson白血病病毒转化细胞系。

RAW 264.7是破骨细胞、炎症研究最常用的体外模型之一。

1. 破骨细胞生成研究：RAW 264.7已被证明在RANKL诱导下容易分化为破骨细胞。

与原发性破骨细胞前体不同，RAW 264.7的分化无需添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。

2. 炎症研究：RAW264.7是筛选抗炎活性物和研究炎症最常用的体外研究模型。

在诱导剂（如脂多糖LPS）的作用下，RAW264.7细胞会模拟炎症反应，释放或上调多种炎症介质如一氧化氮（NO）、环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等。

CRISPR/Cas9介导的miRNA-155敲除模型，帮助探究类风湿关节炎中可抑制RAW264.7细胞产生促炎细胞因子据报道，类风湿关节炎(RA)影响着全世界2100多万人。

RA是一种影响关节的自身免疫性炎症疾病。

它的特征是巨噬细胞和淋巴细胞浸润，滑膜成纤维细胞增殖，最终的关节破坏。

巨噬细胞在RA发病机制中发挥重要作用。

RA炎性滑膜中巨噬细胞数量高于正常关节，与关节疼痛和炎症的严重程度呈正相关。

许多药物已经被批准用于治疗风湿性关节炎，基因或细胞疗法。

MicroRNA 155 (miR-155)在小鼠16号染色体和人类21号染色体的BIC基因中被发现。

在临床和实验模型中，miR-155与RA的发病机制有关，因为它在RA患者的滑膜和滑膜液巨噬细胞中上调。

RAW264.7细胞株的相关信息ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。

细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。

2. 收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。

2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。

RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。

细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。

贴壁特别牢固。

2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。

细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来。

用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。

正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。

[文章编号] 1007-3949(2010)18-09-0687-04#实验研究#RA W 264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定周云,沃兴德,卢德赵(浙江中医药大学生命科学学院,浙江省杭州市310053)[关键词] RAW 264.7细胞; 泡沫细胞; 胆固醇酯; 氧化型低密度脂蛋白[摘 要] 目的 以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为对象,建立简便而又准确的泡沫细胞诱导及鉴定方法。

方法 将实验分为正常对照组和不同浓度氧化型低密度脂蛋白与细胞孵育组,在以孵育时间为24h 的前提下,用MTT 法和流式细胞术来确定诱导泡沫细胞的氧化型低密度脂蛋白合适浓度区间范围,并用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定不同程度泡沫细胞内胆固醇酯含量。

结果 氧化型低密度脂蛋白浓度范围为20~30mg /L 时,细胞存活率已受到显著抑制,并随着氧化型低密度脂蛋白浓度的增高细胞凋亡率和坏死率逐渐增大,起初以细胞凋亡为主,当氧化型低密度脂蛋白浓度大于40m g /L 时凋亡的细胞不断坏死。

20m g /L 和30m g /L 氧化型低密度脂蛋白与RAW 264.7细胞共孵育24h ,细胞内胆固醇酯比重分别为66.26%和71.19%,而10m g /L 的氧化型低密度脂蛋白诱导24h 的泡沫细胞不典型,40mg /L 以上的氧化型低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞泡沫化程度严重,贴壁不牢,大部分细胞破裂或凋亡,脂滴散布于细胞外。

结论 20~30m g /L 氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW 264.7巨噬泡沫细胞模型稳定且形态较完整,符合泡沫细胞的形态学特征。

[中图分类号] R36[文献标识码] AThe M odel Estabilis h m ent and Identification of RA W 264.7M acrophage -D erived Foa m CellZHOU Yun ,W O X i ng -D e ,and LU D e -Zhao(C oll ege of L ife S cience ,Zheji ang Trad itiona lC hinese M e d icine Un iversit y,H ang zhou,Zheji ang 310053,Ch ina )[KEY W ORDS] RAW 264.7Ce lls ; F oa m Ce l;l Cho lestero l Ester ; O x i d ized L ow D ensity L i poprote i n [ABSTRACT ] A i m To establis h t he model o f mur i ne m acrophage RAW 264.7derived foa m ce ll and i dentif y the m w ith si m p le and accura te m ethod . M ethod s T he exper i m ent was dev ided i nto no r ma l contro l group and si x exper i m en -ta l groups of d ifferent concentra tion o f ox i dized l ow density li poprote i n (ox -LDL )incubated w it h ce l.l On the incubati on ti m e for 24hours thatMTT m e t hod and flow cytome try (FC M )w ere used t o deter m i ne t he suitable rang e o f ox -LDL concen -tration ,then measure intra -cell u l ar cho l esterol ester i n different l eve l of m ac rophag e f o a m ce llw ith tota l cho leste ro l and free cho lestero l k it . R esu lts Ce ll v i ab ility had been si gn ifi cantl y i nhi b ited when ox -LDL concentrati on w as a t the rang e o f 20~30m g /L ,when ox -LDL concen trati on w as g reater than 40m g /L,apoptosis cell s conti nuous l y necrosis .O x -LDL a t t he concen trati on of 20and 30m g /L ,incubated w ith ce ll fo r 24hours ,t he propo ti on o f i ntra -ce llular cholestero l este r were 66.26%and 71.19%. F oa m ce ll i nduced by 10m g /L of ox -LDL w as not t yp i ca,l and by 40m g /L o f ox-LDL o r m ore ,severe degree of foa m ce ll l ed to ce lls fl oa ti ng ,m ost ce lls we re rupture o r apoptos i s ,lipi d drop l et d i spersed i n ex tra -cell u -l ar . Con cl u si on O x -LDL a t the concentra ti on rang e o f 20~30m g /L ,i ncuba ted w ith RAW 264.7for 24h ,i nduced foam cell has good m orpho l ogy ,and m ode l stab ilit y ,m ee t the m orpho logy feature of f o a m cel.l[收稿日期] 2010-07-23 [修回日期] 2010-09-05[基金项目] 国家自然科学基金资助(30873366)[作者简介] 周云,硕士研究生,主要从事中药抗动脉粥样硬化研究,E-m ail 为z houyun04yy @163.co m 。

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7向破骨细胞分化的诱导条件耿 欢，林 琛，邢更彦【摘要】 目的 探讨RAW 264.7细胞与向破骨细胞分化的诱导条件，以期提高破骨细胞的数量与活性。

方法 采用不同浓度核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）诱导RAW 264.7细胞4 d 后形成破骨细胞，并通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色和鬼笔环肽染色鉴定破骨细胞，骨板吸收实验检测破骨细胞的骨吸收活性，反转录酶-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测破骨细胞功能基因TRAP 、破骨细胞相关受体（osteoclast-associated receptor，OSCAR）、c-Fos、核转录因子激活的T 细胞1（nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1）的表达。

结果 RAW 264.7细胞经RANKL 诱导4 d 后可出现大量TRAP 呈阳性和纤维肌动蛋白环形成的多核破骨细胞，骨板上形成较多的骨吸收瘢痕，RT-PCR 检测到破骨细胞特殊功能基因信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA）高表达。

结论 RAW 264.7诱导4 d 可产生大量噬骨能力较强的破骨细胞。

【关键词】 RAW 264.7；破骨细胞；抗酒石酸酸性磷酸酶；核因子κB 受体活化因子配体【中国图书分类号】 R329Induction conditions of osteoclasts differentiation from mouse macrophage RA W 264.7 cell lineGENG Huan，LIN Chen，and XING Gengyan. Department of Joint limbs in Orthopedics center, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039 , ChinaCorresponding author: XING Gengyan, E-mail: xgy7766@【Abstract 】 Objective The study aimed to explore the induction conditions of RAW 264.7 cells differentiation into osteoclasts, with the view to improving the amount and activity of osteoclasts. Methods The RAW 264.7 cells were induced with different concentrations of receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) for 4 days to differentiate into osteoclasts, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and phalloidin staining were used to identify the osteoclasts, the Osteo Assay Surface Plate was used to measure the bone resorptive activities of osteoclasts, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of osteoclast phenotypic and functional genes TRAP, osteoclast-associated receptor (OSCAR), c-Fos and nuclear factor of activated T-cells 1 (NFATc1). Results RAW 264.7 cells induced by RANKL 4 days, could differentiate into multinucleated cells and a large number of fibrous actin rings formed by TRAP positive 1fibers and fibrous actin ring; Bone resorption pits were found on the surface of bone plate by microscope; RT-PCR detected that high expression of message ribonucleic acid (mRNA) made by the gene messenger of osteoclasts for special function. Conclusions The RAW 264.7 cells induced for 4 days can differentiate into a large number of osteoclasts with strong bone resorption activity.【Key words 】 RAW 264.7； osteoclast; tartrate-resistant acid phosphatase；receptor activator of nuclear factor κB ligandDOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2017.03.006基金项目：国家自然科学基金（11405185）作者单位： 100039 北京，武警总医院骨科中心关节四肢科通信作者： 邢更彦，E-mail：xgy7766@ 骨的生理平衡是通过成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收维持的[1]。

RAW264.7细胞株的相关信息ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。

细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。

2. 收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。

2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃，5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。

RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。

细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。

贴壁特别牢固。

2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。

细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来。

用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。

正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。

RAW264.7细胞株的相关信息ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。

细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。

2. 收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。

2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。

RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。

细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。

贴壁特别牢固。

2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。

细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来。

用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。

正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。

北京索莱宝科技有限公司小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，RAW264.7贴壁培养细胞名称：小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，RAW264.7生长特性：贴壁生长培养条件：DMEM高糖，10%FBS传代方法：1:3-1:6传代；2-3天一次冻存条件：细胞冻存液特征特性：此细胞株源自Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。

可产生溶菌酶；sIg-,Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原阴性。

此细胞株不分泌可检测到的病毒颗粒，XC斑点形成试验阴性。

可以胞饮中性红并吞噬乳胶颗粒与酵母聚糖；可以抗体依赖性地分解绵羊红细胞与肿瘤靶细胞。

LPS或PPD处理2天可诱导分解红细胞，但对肿瘤靶细胞无作用。

细胞处理方法：1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超净台中操作。

2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%的CO2的温箱中继续培养。

细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。

3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。

特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。

2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。

3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。

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RA W 264.7巨噬细胞的扫描电镜样品制备与观察刘 博1,路 菊2,江 澈3,陶忠芬2(1.解放军第210医院检验科,辽宁大连116021;2.第三军医大学基础医学部中心实验室,重庆400038;3.重庆三峡中心医院培训中心,重庆万州404000)[摘 要] 目的 探索贴壁细胞扫描电镜样本最佳制备方法及仪器工作参数调节与图像质量之间的关系。

方法 通过对样品制备中清洗、脱水、镀膜步骤的对比试验,调整样品处理的次数、时间、样品台距离、喷涂厚度,获得最佳制备条件;优化电镜加速电压、物镜光阑、工作距离,得到最佳工作参数。

结果 制备RAW 264.7巨噬细胞扫描电镜样品的最佳方法是用0.1m o l/L PBS 清洗2次,每次5m i n ;30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水,每次3m i n ;镀膜导电时靶与样品之间距离为5c m,真空度1.33~13.33Pa ,电流10mA,时间150s ,间断镀膜。

观察样品时最佳工作参数设置为加速电压10kV,物镜活动光阑孔50 m,工作距离12mm 。

结论 制备样品程序中清洗、脱水、镀膜条件的设定及仪器的加速电压、物镜光阑孔大小、工作距离的优化,有利于获得清晰、细节丰富、反差适中、立体感强的扫描电镜图像。

[关键词]扫描电镜;贴壁细胞;制备样品;工作参数[中图分类号]Q 336 [文献标识码]A [文章编号]1672 5042(2011)01 0062 04[作者简介]刘 博(1986-),男,黑龙江省大庆市人,检验技师,学士,主要从事临床检验及扫描电镜技术方面的研究。

电话:(0411)85841279 [通迅作者]路 菊(1964-),女,高级实验师,第三军医大学基础部中心实验室。

电话:(023)68752350[收稿日期]2010 09 20 [修回日期]2010 10 08P reparation and observation of scanni n g e lectron m icroscopy speci m en of RA W 264.7m acrophages LIU Bo ,LU Ju ,JIANG Che ,TAO Zhong fen (C linical L aborato ry ,210th H osp ital o f PLA,D ali an L i aoni ng 116021,China)Abstract :O bjective T o expl o re t he bestm ethod for prepar i ng t he scann i ng e lectron m icroscopy (SE M )sa m ples of adherent cells and to i nvestigate t he re l ationsh i p bet w een ope rati ng param eters and i m age qua lity .M e thods T he best prepa ri ng condition was ob tai ned by ad j usti ng the processing ti m e and frequency ,distance to the spec i m en stage and the coa ti ng t h ickness after compar i ng t he procedures i n clean i ng ,dehydra ti ng and coating .The opti m u m w ork i ng para m ete rs were fixed t hrough opti m izi ng the SE M acce l e rating vo ltage ,ob j ec tive ape r t u re and wo rking d i stance .Resu lts T he best m ethod f o r prepar i ng SE M sa mp les o f macrophages i n RAW 264.7rats w as as fo llo w s :w ash t w ice w ith 0.1m o l/L PBS ,5m i n once ,dehydrate w it h graded ethano l (30%,50%,70%,90%,100%),3m i n once ,conduct the coat i ng procedure i ncons i sten tly for 150s and fix the distance bet ween t he targ et and the spec i m en at 5c m ,t he vacuum pressure at 1.33~13.33Pa and t he current at 10mA.T he best operati ng pa ra m e ters for speci m en observati on w ere desi gned as f o ll ow s :speed i ng vo ltage 10k V,ob jecti ve ac ti ve aperture 50 m,t he wo rk i ng d istance 12mm.Conc l usion It i s he l pful to obta i n i deal i m ag es w ith abundan t deta ils ,propercontrast and strong stereoscopic v i sion by desi gn i ng the procedures i n c l eani ng ,dehydra ting and coati ng and opti m i zi ng t he acce lerati ng vo ltage ,ob j ec tive aperture and w ork i ng distanceK eyword s :scann i ng e l ectron m icrscopy ;adherent cell s ;spec i m en prepara ti on ;operati ng param eter随着扫描电镜(SE M )的普及和发展,扫描电镜已经从高层次的研究发展成为应用广泛的测试手段[1]。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代： RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢，普通的方法根本就不可能将它消化下来，这也是养这种细胞最头痛的问题。

现将我的一点心得，简介如下：消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶RAW264.7RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。

我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶： 1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗一至两次；弃去 2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞 3.分入新的培养瓶； 4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。

我一直是直接用弯嘴滴管吹打的。

也不费力，只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。

吹打一遍之后，置镜下观察哪里还有未吹下的细胞，再着重吹打。

对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢结伴的。

正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。

片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。

所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。

RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。

生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。