血红蛋白的提取和分离-PPT课件

血液有哪些成分？
水分 血浆
固体物质
血 液
血细 胞
白细胞
血小板
红细胞 （最多）
思考
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
血红蛋白
两个α—肽链 两个β—肽链 四个亚铁红素基团
血红蛋白的特点：
血红蛋 白
两个α—肽链 两个β—肽链
四个亚铁红素基团
㈠.蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
㈡.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤
⑶.常见电泳类型： ①琼脂糖凝胶电泳
②聚丙稀酰胺凝胶电泳
迁移率取决于它所带净电 荷的多少以及分子的大小、
形状。
③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳
电泳迁移率完全 取决于分子的大
小。
课外拓展： 用SDS测定蛋白质分子量的方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分 子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行 电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置， 用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定 未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子 量及低分子量的标准蛋白试剂出售。
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装 填。
一、凝胶色谱法（分配色谱法）
⑴.概念：
根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小， 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分 离。
大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼 脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。
实践训练
1.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是( )
AC..糖蛋A类白化 质合物
B.脂质 D.核酸
2.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因
素是( )
A.蛋白质分子所带的电荷 B.蛋白质分子的形状
C.蛋白质分子的相对质量C D.缓冲溶液的pH
3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是( )
百度文库
3.缓冲溶液的配制
三、电泳：
⑴.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相 反的电极移动。
琼脂糖凝胶电泳示意图
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
⑵.电泳原理： 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及
分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3次洗涤后的 结果
②洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数 不可过少。
(2)血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
(3)分离血红蛋白溶液：
甲苯层（无色透明）； 脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 杂质沉淀层（暗红色）。 过滤：除去脂溶性物质沉淀层和杂质沉淀层。
A.改变蛋白质分A子通过凝胶时的路径
B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度
C.将酶或细胞固定在凝胶中
D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度
4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是
()
C A.使酶的活性最高
B.使蛋白质的活性最高
C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷
血红蛋白的提取和分离
学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法， 并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋 白的提取中分别起到什么作用。
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的 原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
1.样品处理： 思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？ 答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提 取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富便于提取血红蛋白。
(1)红细胞的洗涤: ①洗涤操作：
柜式离心机
初次离心后的 结果
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
二、缓冲溶液
1.概念:
在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或 强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合 溶液。
2.缓冲溶液的组成举例：
H2CO3 —— NaHCO3、CH3COOH —— CH3COONa NaH2PO4 —— Na2HPO4、KH2PO4 —— K2HPO4
⑵.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
⑶.凝胶色谱法的原理—分子筛效应： 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对
分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路 程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白 质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动， 路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋 白质分子因此得以分离。 ▲依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
四、实验操作——血红蛋白的提取和分离
1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或
化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、
所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分 子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
⑵.凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择： ②凝胶的前处理： ③凝胶色谱柱的装填方法： 注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2.装 填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗 脱次序，降低分离效果。
④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，
在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸
缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。
注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡
50c
混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物
(4)透析(粗分离)：
①过程：取1ml的血红蛋白溶液装 入透析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的物质的量浓度为20mmol/l 的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透 析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量 较小的杂质。
利用透析袋透析
透析过程动画演示
2.凝胶色谱操作:
⑴.凝胶色谱柱的制作：
注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面， 否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。