大肠杆菌与遗传测序

实时定量RT-PCR系统示意图，浙江大学，张云霞，2013.04
数据采集处理：采用自编的Labview程序读取各个循环荧 光照片上液滴的荧光强度值,得到荧光强度随反应循环数增 加的变化曲线。以各条曲线前10个循环荧光强度值Rn的标 准偏差的10倍作为阈值,取大于阈值的循环数作为CT(临界 循环次数)值。以加入miRNA-122的拷贝数的对数值作为 横坐标,CT值为纵坐标拟合出标准曲线。 （ 了解）
多步浓缩富集方法对地表水中大肠杆菌的检测
小结：为了提高检测灵敏度,能够实现实际样品中低浓度细菌的测
定,将堆积、扫集和其它预浓缩方法的联合使用是必要的。我们通
过使用微流控芯片展示了多步浓缩方法(CS扫描、反转电场和场放 大样品堆积)可以用来加强细菌富集,实现低浓度污染的样品的测定。
对比于常用的细菌检测方法,多步方法具有高灵敏度、低样品需耗
微流控芯片系统的条件：用于实验的“十字”通道微流控芯片微 通道深为25 宽为100 um。分离通道长为50 mm,其他通道与交叉 口的距离为10 mm。铂电极作为电源与溶液之间的导电电极。芯 片使用之前需要用98 %的浓硫酸和去离子水各冲洗10 min。随后, 用1 mol/L NaOH冲洗通道20 min,再用去离子水冲洗10 min,最后 用运行缓冲溶液清洗10 min。芯片清洗过后,将含有CS（壳聚糖） 的分离缓冲芯片对通道进行预涂敷处理。 （参考）
小结：本工作中,我们发展了一种半敞开式的纳升级平面液滴阵 列平台,并将其应用于miRNA-122的实时定量RT-PCR检测中。 利用平面液滴的优势,在经表面修饰的亲水点阵列芯片上,实现了 液滴的定位和多步加样操作。该芯片具有加工简单、操作灵活、 易于普及等优点,可以作为一种通用型的生物化学反应平台使用。 此外,该系统可在试剂消耗、检测通量及系统集成化微型化等方 面进一步优化改进,有望在大规模高通量分析领域发挥重要的作 用。 （知道）
实验材料及试剂： 单晶桂片(N111型):上海齐鸣桂材料有限公司,上海。 氧化锡铟(ITO )玻璃(1.1 mm厚,lOohm/m2):深圳莱宝高科技股份有限公司,深圳。 AZ4620光胶:安智电子材料公司,苏州。 环氧树脂(合众全透明AAA超能胶):浙江黄岩光华胶點剂厂,黄岩。 荧光素纳(产品编号:FT0989 ):上海生工生物工程股份有限公司,上海。 氟化铵(NH4F):国药集团化学试别有限公司,上海。 氢氧化纳(NaOH):国药集团化学试剂有限公司,上海。 浓硫酸(H2SO4):国药集团化学试劍有限公司,上海。 氢氟酸(HF):国药集团化学试刻有限公司,上海。 硝酸(HN03):国药集团化学试劍有限公司,上海。 异辛院:国药集团化学试剖有限公司,上海。 无水乙醇(C2H5OH):国药集团化学试剂有限公司,上海。 （了解）
量和快速分析的优点。（知道）
1.2、纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究 综述：基于平面液滴阵列的微流控系统具有系统简单、成本低廉、 液滴操控灵活、适于多步集成操作及液滴后续操作等优点,在微流 控系统的实时定量PCR技术显示了广阔的应用前景,尤其是基于液 滴的PCR系统。液滴微反应器将反应液分隔在单分散体系中,减少 了 PCR歧视及非特异性扩增;反应体积可为纳升至皮升级,与细胞 体积相当,能够有效限制内容物的扩散,降低背景对信号的稀释作用; 通过不溶相使液滴微反应器与微通道内壁间隔开来,最大限度地减 少了通道内壁对试样的吸附,消除了交叉污染。（知道）
细菌悬浮液的准备：大肠杆菌在 LB 培养基 30 度下培养 13 h。在 3400 rpm（每分钟转数）离心5min,上清液去除,再次用无菌水对 细胞进行清洗,离心,重复这个过程5次以去除残留的培养基并且达 到清洗细胞的目的。近红外核酸荧光染料SYTO 62用来标记细菌 细胞。最后,标记的细菌细胞悬浮在含有牛磺酸的缓冲溶液,浓度约 1.0x107CFU/mL。在每次使用之前,新准备的细胞悬浮液需要漩祸 60-90 S以避免细胞聚集。（了解）
技术条件：实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或
qRT-PCR)技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核 酸(包括DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生 物学检测技术,已经广泛地用于分子诊断,疾病研究,临床医学等领域。 qPCR技术遵循传统PCR的扩增原理,不同的是在每一个循环的退火或 延伸阶段进行实时荧光检测。根据溶液中模板的原始拷贝数的对数与 扩增循环数Ct存在的线性关系,对核酸进行定量分析。实时定量PCR 技术具有准确度高,灵敏度高及检测范围宽(超过5个数量级)等特点,因 此非常适用于miRNA的定量检测。 （知道）
标准条件下多步浓缩富集方法对大肠杆菌的定量检测曲线。
自然水体中大肠杆菌的检测：由于地表水中细菌的浓度 经常<30 CFU/mL,具有较高富集倍数的检测方法才能测 定河水中的大肠杆菌。此外,因为河水中常含有CO32-、 SO4 2-等，运行缓冲的电导率远远低于河水。由于使用的 浓缩方法部分是基于运行缓冲和样品缓冲中不同的电导 率,因此必须过滤水样以去除水中含有的离子。此外,经过 预富集的细菌水样的浓度必须达到多步浓缩方法的检出 限。因此可以通过无菌滤膜过滤预富集水样中的大肠杆 菌。
材料和仪器 三羟基甲基氨基甲烧(Tris),硼酸,乙二胺四乙酸(EDTA) 购买于Aldrich公司(Milwaukee,WI,USA)。壳聚糖,牛 璜酸和半胱氨酸购买于上海国药集团。大肠杆菌、E. coli)购买于广东微生物种质资源库。所有的实验在自 制的微流控-激光诱导焚光检测系统(MCE)上实施。微 流控系统主要由上海光谱有限公司提供。 (了解)
实验溶液配制： 硅烷化试剩:将OTCS与异辛烷混合作为硅烷化试剂,体积比为0.1%-1% 均可,现用现配。 芯片刻姓液分别量取HF16mL、NH4F 7.4 g. HNO319.2 mL.去离子 水364.8 mL在塑料器皿中混勻,配置成摩尔浓度比HF: NH4F; HNO3为1: 0.5:0.75的芯片刻烛液,常温保存,可重复使用。 光刻显影液:称取0.7 g NaOH固体溶解于100 mL去离子水中,配置成0.7 %NaOH溶液,作为光刻显影液。 0.1 M荧光素纳溶液:用于多步加样过程的观察。 成熟 miRNA-122 ( mir-122, UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG )序列 来源于 Sanger Center miRBase ,由上海吉玛制药技术有限公司(上海)负 责合成。 2% RNase清除剖(体积比):使用娃哈哈纯净水稀释RNase清除刻,用于芯 片及PCR耗材清洁。 （了解）
由于CS（壳聚糖）带有大量正电荷因此常被用于絮凝吸附 剂和不同作用的绑定试剂。因为在细菌和病毒细胞外膜表面具 有羟基和磷酸根基团,常使其带负电荷,CS与细胞可通过静电作 用可使其聚集。并且CS也常作为天然抗菌剂被大量使用。因 此,CS的高吸附能力可使其用于细菌浓缩,并且作为扫集试剂可 以保持细胞的活性。此外,通过将CS扫集、场放大样品堆积和反 转电场富集技术联合使用,在微流控芯片上一体化实现了多步浓 缩检测方法。（知道）
主要通过检测什么检测大肠杆菌
主要通过检测什么检测大肠杆菌： 1、菌落数量 2、大肠杆菌生成物间接检测 (β-半乳糖苷酶, β-葡萄糖醛酸酶) 3、表面抗原 4、DNA
1、芯片化的大肠杆菌检测法
1.1、在线富集技术在微流控芯片上实现低浓度细菌微生物 超灵敏检测
背景：由于在水、食品和临床样品病菌的感染剂量可能非常低,为 了能够快速测量存在于实际样品中低浓度的病原微生物,科研工作中己 经投入了相当大的精力到这一领域。本文通过将壳聚糖(CS)扫集,反转 电场堆积和场放大样品堆积多步浓缩方法联合,在芯片上实现了细菌的 高效检测。（了解）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实验材料及试剂： 溶融石英毛细管:河北永年锐洋色谱器件有限公司 Tygon（聚乙烯） 管: Saint-Gobain Performance Plastics,Franceo 微量注射器(10 pL,1701N ): Hamilton, Switzerland。 DMEM （细胞培养基）高糖培养液: Gibco, Life Technologies, USA。 FBS（胎牛血清）: Gibco, Life Technologies, USA。 PBS（磷酸盐缓冲液） (PH 7.2): Gibco, Life Technologies, USA。 生理盐水(0.9%NaCl溶液):浙江大学校医院,杭州。 Calcein-AM (活细胞荧光染色别 ) Invitrogen, Life Technologies,USA。 （了解）
实验芯片： 亲水点阵列芯片加 工，采用CorelD RAW X3软件绘制 芯片掩膜图。硅片 为直径76 mm的圆 形薄片,每块桂片可 加工出7块 13X13mm芯片。芯 片设计成6 X6点阵, 点直径为0.5 mm, 间距为1.7mm。 （参考）
实时定量RT-PCR系统构建：将芯片置于商品化基因扩增仪 (MGL96G/Y,杭州朗基科学仪器有限公司)的载物合上,用PCR仪控制 热循环温度。将ITO玻璃罩在芯片上方,结合自制的温度控制模块,维 持温度恒定,以起到热盖的作用。以汞灯作为荧光激发光源,利用 Nikon体视荧光显微镜(SMZ1500, Nikon, Japan )的光路系统采集荧 光。用 Labview( Labview 8.0,National Instruments, Austin, USA )程序控制 CCD ( 电荷耦合器件)和自制的挡光阀,在每个循环退 火阶段拍摄荧光照片。 （图）
微流控芯片多步浓缩方法用于细菌检测：对于场放大细菌堆
积,与运行缓冲溶液相比,细菌细胞应该分散在更低电导率的样 品缓冲溶液中。牛磺酸能够使细胞聚集从而改善检测灵敏度,将 少量的牛磺酸添加到悬浮液中。下图是芯片电泳五步浓缩过程 示意图。通过施加相应的电压对细菌细胞进行在线富集和浓缩。 （图）
细菌在线富集分离机理示意图。 (A)预上样;(B)进样,(C)场放大样品堆集和扫集,(D) 反转电场富集,(E)分离。黑色区带代表浓缩的细菌样品,灰色代表样品基质,空白代 表含有CS（壳聚糖）的运行缓冲,箭头表示电渗流方向。 Analytical Chemistry, 2012,84,1687 ，华东师范大学，王志芳
Labview数据采集系统软件界面
芯片清洗及注意：每次使用后,使用医用脱脂棉蘸洗海刻搓洗芯片 表面,再分别用去离子水及娃哈哈纯净水冲洗。清洗表面后,将芯 片置于2%RNase清除剂中浸泡5min,以减少RNA降解,避免PCR污 染。用娃哈哈纯净水冲洗后,在烘箱中65 °C-80°C烘干30min。 清洁后的芯片置于干净的培养皿中,室温存放。实验中经清洗后的 芯片不会产生PCR污染,可反复使用。芯片最长使用时间可达一年。 本实验全程需佩戴口罩及乳胶手套。芯片硅烷化、光刻及湿法刻 烛过程中,使用试刻的挥发性和腐蚀性较强,尽量在通风橱内操作。 玻璃研磨过程中要带防护眼镜以保护眼睛。 （知道）
背景：MicroRNA ( miRNA )是一类非编码的小RNA序 列,其长度只有18-25个碱基。越来越多的研究证 明,miRN A 在很多基因的表达过程中起到了分子开关 的作用,在许多癌症及重大疾病的发生和发展 中,miRNA都出现了异常表达现象。因此准确对 miRNA进行定量检测具有重要的生物学和临床意义。 （了解）
1.3、基于纳升级液滴阵列的自动化单细胞实时定量RTPCR系统的研究
综述：研究基因型与表现型之间的关系是生物学及医学发展的重要环节, 以定量测定细胞内各类RNA表达为目标的转录组研究对于基因表达和分 子诊断研究尤为重要。同一器官中的所有细胞具有特定的基因型,而细胞 个体之间基因表达却有很大差异,这就造成了细胞亚群的分化,并具有不同 的生理功能、应激行为及表现型。由于这种细胞异质性的存在,转录组研 究需要在单细胞水平进行。因而，针对单细胞的基因分析为大量细胞中 稀少变异细胞的检测提供了方法,特别对重大疾病与癌症的早期诊断、胚 胎植入前遗传学诊断、微生物亚群分类及法医鉴定等研究具有非常重要 的作用。 （了解）