病毒的分离培养标准操作规程
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病毒的分离培养标准操作规程
1.目的:规范病毒分离及鉴定培养操作流程,保证试验结果的重复性和稳定性。
2.术语:EID50/0.1ml,ELD50/0.1ml,TCID50/0.1ml,CPE
3.操作程序与方法:
3.1 采样:对于病死或剖杀动物,采集病毒主要聚集组织部位,一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等;对于活体动物,可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位(口腔、鼻腔、生殖道、肛门等)的分泌液。采集样品如不能立即处理,应冻存与-20℃备用。长
途运输应用冰盒或4℃低温保存。
3.2 样品处理:组织块可用剪刀剪碎并研磨,加入10倍体积含300-500UI/ml青、
链霉素的生理盐水(PBS),反复冻融2-3次。棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水(PBS),反复冻融2-3次。8000rpm离心15min,取上清液用0.22μm滤膜过滤,透过液即为病毒原液,收集保存,短期保存4℃,长期保存用液氮。
3.3接种培养:将病毒原液接种与特定细胞单层中,连续盲传4-6代,观察细胞是
否产生特异性CPE,并计算及TCID50/0.1ml。禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定,并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。
3.4 病毒纯化:采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化;
3.5 动物回归实验:分离培养并纯化好的病毒回归接种动物,观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。
3.6分子生物学鉴定:基因组提取并设计特异性引物,对分离病毒保守区基因片段
进行特异性扩增,并测序,从分子水平对其进行鉴定。
3.7血清学鉴定:用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞
或鸡胚验证病毒特异性。或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。
4.注意事项
4.1采样过程应做好自身防护,烈性病不得随意分离。
4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理,避免病毒扩散到环境中。
4.3 纯化好毒种应及时做好扩毒并建立毒种库。
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