生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology

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胶球大小-介质离子粗细影响流动
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二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相， 液体为流动相的系统中进行的。离子交换 剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方式进行，或借助 离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离 子化合物的吸附作用进行。
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两大类离子交换介质
由介质带电基团的不同，可分为两大类： 介质－带电基团(counter ion) (1) 阳离子交换介质 (cation exchanger)： 载体-阴离子基团 ..... 阳离子 (2) 阴离子交换介质 (anion exchanger)： 载体-阳离子基团 ..... 阴离子
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对 酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等） 以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M （如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L， 或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束 缚特异物质的能力。
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特异性配体亲和层析ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ与通用性配 体亲和层析法
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凝胶过滤层析柱
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胶球大小-介质离子粗细影响流动
(1) 胶球颗粒有一定大小，一般可分为 corse, medium, fine, super fine 四种粗细 (grade)；越粗的胶体，流率越好，但分 辨率越差。 因胶球外面的缓冲液是由胶球表面向内扩散， 样本蛋白质也是以扩散方式进入胶球，再由中心向外扩散 出来。胶球半径越大，扩散距离越大，效果越差。 (2) 下图说明这种扩散介质的机制。 而近年来因材料科学的 进步，发展出通透性特强的胶球，缓冲液可直接浸润而进 入胶球，不需经过扩散作用，是为dispersion弥散式的胶体， 效果较好且快速。商品化称为 perfusion chromatography。
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金属螯合亲和层析
a. 许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可 能会吸附该金属。 b. 若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会 专一性地吸附需要此金属的蛋白质。 c. 基因操作时，经常在表达蛋白质的末端加上一 段含有六个 His 的片段；则此表达蛋白质，可以 吸附到含有镍的吸著剂上，可以用咪唑流洗出 来。 d. 这种载体上结合有某些可与金属产生配位键 的基团 (如 nitrilotriacetic acid)，这些基团与金 属离子结合 (如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂。
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
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主要内容 Contents：
一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of
Nucleic Acid
二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization － Southern,Northern
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反相层析法
(1) 是 HIC 及离子交换法的综合体，但属于一种 partition 层析；可使用离子交换 (或类似 HIC) 的介质。 (2) 混合极性及非极性溶液为流动相，当流动相 通入介质后，介质表面可固定其中的极性溶液 (若使用 HIC 介质则固定非极性者)，样本分子会 在此二相中进行 partition 分离。 (3) 因固定相及流动相的极性刚好相反，故名 reverse phase。
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疏水性层析法
(1) 蛋白质分子表面有部份疏水性区域，若在一极 性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定相载 体上；若环境的极性降低，则可被洗脱出来，即为 疏水性层析法 (hydrophobic interaction chromatography, HIC)。
(2) HIC 没有亲和层析析法那么强的专一性，较似 离子交换法，但所根据的作用力，则是非极性基团 间的疏水性引力。
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阳离子： 两价阳离子 > NH4+ > K+ > Na+ > H+ > Li+ 阴离子： I - > Br - > Cl - > HCO3- > CH3COO-, OH-
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四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激 素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类 似，每对反应物之间都有一定的亲和力。在亲 和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分 子之间具有亲和力，并产生复合物。
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1 表达蛋白质的分离沉淀
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蛋白质分离
培养基
收集菌体 洗涤
上清液
破碎细胞
超声破碎 化学法 溶菌酶
分级沉淀
等电沉淀 盐析沉淀 高分子物 质
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1.1 凝胶过滤层析
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝 胶小球具有网状结构，小分子物质能进 入其内部，而大分子物质却被排除在外 部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱 时，溶液中的物质就按不同分子量筛分 开了。
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特异性配体亲和层析法：配体一般为复杂的生 命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物 等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合 力。
通用性配体亲和层析法：配体则一般为简单的 小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等）， 它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善 吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
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and Western Blot
六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library
and DNA Library
七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and
Expression
八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein