分子生物学检验

第二章临床分子生物学检验标志物

1、分子生物标志物:指可以反映机体生理,病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子,就是生物标志物的一种类型。

2、中心法则:指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录与翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这就是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)与在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)就是对中心法则的补充。

3、基因组:就是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质,包括基因与非编码DNA。

4、原核生物基因组特征:

1)原核生物基因组较小:大小一般在106—107碱基对之间;

2)原核生物的类核结构:原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区,没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下,以一定的形式盘曲,折叠包装起来,形成类核;

3)原核生物的操纵子结构:原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号,共同组成了一个基因表达单位,即操纵子结构;

4)原核生物的结构基因:原核生物的结构基因中无内含子成分,多数就是单拷贝基因,基因与基因之间有重复序列存在;

5)具有编码同工酶的基因:这类基因表达产物的功能相同,但基因结构不完全相同;

6)含有可移动DNA序列:可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组,改变生物体的遗传性状,使生物体更适应环境的变化;

5、质粒:指细菌细胞染色体以外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子;

6、人类基因组包括细胞核内的核基因组(3X109bp)与细胞质内的线粒体基因组(16569bp),人类基因组中存在大量的非编码序列与重复序列;

7、小卫星DNA:由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次,形成的1—5bp 的短DNA,又称可变数目串联重复;

8、微卫星DNA:核心序列为1—6bp,可以重复上百次,又称短串联重复;

9、多基因家族:指由某一祖先基因经过重复与变异所产生的一组基因,在多基因家族中,某些成员并不产生有功能的基因产物,这些基因称为假基因;

10、多态性:当某种变异相对常见,在群体中的频率高于1%时,则称为多态性,频率低于1%的

变异称为突变;(错义突变,无义突变,RNA加工突变);

11、多态性类型:限制性片段长度多态性;小卫星与微卫星多态性;单核苷酸多态性(主要指在

基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性);拷贝数多态性(指基因组中较大的片段(200bp—2Mb)发生了拷贝数的变化);

12、DNA甲基化:

(1)定义:指生物体在DNA甲基转移酶的催化下,以S—腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程;

(2)作用位点:腺嘌呤的N—6,胞嘌呤的N—4,鸟嘌呤的N—7,胞嘧啶的C—5;

(3)作用机理:

13、微小RNA:就是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸,

在细胞内主要发挥基因转录后水平调控作用;

14、长链非编码RNA:长度大于200bp的非编码RNA;

第四章:核酸杂交技术

1、融解温度(Tm):DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生,这一温度范围的中点被称

为融解温度;Tm值的大小取决于核酸分子的G-C含量。G-C碱基含量越高,Tm值越高; 2、变性:在一定条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,DNA分子成为单链,形成无规则线

团的过程;

3、复性:变性DNA只要消除变性条件,具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链的

过程;

4、Southern印迹杂交:

过程:1)将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹;2)固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度与离子强度下退火,即分子杂交过程;

原理:利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其她固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA 分子的含量;

特点:特异性与灵敏度高;

5、Northern杂交靶核酸就是RNA,Southern杂交靶核酸就是DNA;

第五章:核酸扩增技术

1、聚合酶链反应技术(PCR):由美国Cetus公司K、Mullis博士于1983年建立,它就是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程,也就就是能在体外特异地扩增一段特定核酸序列的技术;

2、PCR的基本原理:根据DNA半保留复制的机理与体外DNA分子于不同温度下可变性,复性的性质,通过人为控制体外合成系统的温度,通过变性、退火、延伸三个步骤扩增目的DNA 片段;

3、PCR的基本过程:

1)变性:将被复制的DNA片段在高于其熔点温度(Tm)的条件下(94~95℃)加热,使DNA双螺旋结构的氢键断裂而解螺旋,形成两条单链分子作为扩增反应的模板,以便与引物结合;

2)退火:将反应体系的温度降低至引物的熔点温度以下(

3)延伸:将反应体系的温度升至72℃,此时反应体希按照模板链的序列以碱基互补配对的原则依次把dNTP加至引物的3’端,在Taq DNA聚合酶的存在下,杂交链不断延伸,直至形成新的DNA双链;

4、当温度升至其熔点温度(Tm)时荧光量急剧下降而形成熔点曲线,其波峰所在温度即代表被检DNA分子的Tm值。Tm值的大小取决于DNA分子的长度与其序列中G/C碱基含量; 第六章:核酸实时定量检测技术

1、实时荧光定量PCR技术:指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应过程,最后通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术;

2、扩增曲线:指在实时荧光PCR扩增过程中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测与连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,检测到的荧光信号的变化可以绘制成一条以循环数为横坐标,以PCR反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线;

3、荧光阈值:指在实时荧光定量PCR扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在指数扩增阶段的任意位置上;

4、循环数:PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数;

5、扩增效率:指PCR反应一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值,其值在0~1之间;

6、