第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
2.1引言
醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法
2.2.1材料与仪器
分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备
Tab 2.2.1.a Main instrument equipment
主要仪器型号厂家
生化培养箱
双目生物显微镜
分析天平
手提式不锈钢蒸汽灭菌锅
超净工作台
精密数字式酸度计
PYX-250S-A
BME（BA/E3）
BS224S
DSX-280B
SW-CJ-1FD
pHS-3C
长沙科技
科力仪器
德国莱卡
北京化丰
上海南鹏
上海科技
试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]
表2.2.1.ｂ培养基成分表
Tab 2.2.1.ｂMedium composition
名称葡萄
糖
酵母
膏
无水乙醇
(v/v)
琼
脂
CaCO3备注
⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5
⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然
⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然
⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然
⑸改进后的斜面液体
保藏培养基
1%1%3%2%1%pH自然
⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5
⑺Horyer-Frateur培养
基
3%pH自然
⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然
⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%
⑾产5-酮基葡萄糖酸
盐培养基
3%1%2%2%pH自然
⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH
7.2
⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2
⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
2.2.3醋酸菌的分离纯化
2.2.
3.1分离纯化实验
称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，
涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。
连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4℃的冰箱。
2.2.
3.2 革兰氏染色实验
将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.
3.3产醋酸定性实验[38]
取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇，32℃震荡培养60 h，取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液（2.5 mol/L）调节pH至7.0，加入5~6滴5% FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39]为醋酸菌。
2.2.
3.4醋酸定量实验
经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32℃、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。
醋酸定量测定[40]：
精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加1~2 滴0. 5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L)=(V-V0)×C NaOH×60/样品毫升数；
式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；
V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；
C NaOH=NaOH溶液的浓度(mol/L)；
60为醋酸分子量。
2.2.
3.5耐酒精能力实验
初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32℃恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。
