氨基酸生产工艺课件(PPT 55页)

• 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统 研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得 利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体 菌是尚待解决的问题。
3.1.2 载体的构建
• 有效的载体需要有在受体菌中可启动的 复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内 源小质粒中获得;
• 载体所需的筛选标记及外源基因插入的 多克隆位点，可从常用的克隆载体中获 得。
• 细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有 近缘关系的微生物之间进行并较难成功。
• 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础 上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支 点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代 谢网络。
• 其主要步骤为:
• 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶);
• 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如 定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点 (增强活性或稳定性、解除反馈抑制等);
• 日本在美国、法国等建立了合资的氨基 酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍 生物。
• 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司, 湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产 品质量还难于与国外抗衡。
• 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发 酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术 和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达 六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆 明康普莱特,但生产原料都依赖进口。
• 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居 世界首位。
• 产生菌株特点： • 革兰氏阳性 • 不形成芽胞 • 没有鞭毛，不能运动 • 需要生物素作为生长因子 • 在通气条件下才能产生谷氨酸。
• 谷氨酸生物合成机理：
• 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷 氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性 氨化作用而得到。
• 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和 过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进 谷氨酸产生菌的生长。
• 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害 作用。
• 生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。
浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。 过少菌体生长缓慢，发酵周期长。
与其它培养条件的关系：氧供给不足， 生物素过量时，发酵向其它途径转化。
• 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨 酸、半胱氨酸和酪氨酸
• 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙 氨酸。
• 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物 的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目 的。
• 生产氨基酸的大国为日本和德国。
• 日本的味之素、协和发酵及德国的德固 沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能 生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制 剂的生产。
2.1 用野生株的方法
• 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵 生产的一种方法。
• 典型的例子就是谷氨酸发酵。 • 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵
离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷 氨酰胺和缬氨酸发酵
2.2 用营养缺陷变异株的方法
• 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合 成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体， 使生物合成在中途停止，不让最终产物 起控制作用。
菌株的育种
• 从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件. • 在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制
的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。 • 随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融
合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方 法构建生产菌株的尝试。 • 随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日 益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。 • 苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生 产。
• 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、 磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。 pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32℃ 培 养12h。
• 据专家估计,到2000年,世界氨基酸产值可达45亿 美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可 达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。
氨基酸发酵生产发展的历回顾
• 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主 要原料的培养基中培养微生物,积累特定 的氨基酸。
• 这些方法成立的一个重要原因是使用选 育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。
• 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH 高，糖耗慢，周期长，酸产量低。
• 采取措施：少量多次流加尿素，维持最 适生长温度，减少风量等，促进菌体生 长。
氧对氨基酸发酵的影响及其控制
• 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵： 生物合成与TCA循环有关。
• 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙 氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产 量最大。
限制精氨酸的浓度可解除 反馈抑制，实现鸟氨酸的 生物合成。
消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
• 使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。
促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成
• ATP的积累可促进氨基酸的生物合成
氨基酸发酵的工艺控制
• 培养基 • pH • 温度 •氧
培养基
• 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙 醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利， 氨基酸的转化率降低。 菌种性质、生产氨基酸种类和所采用 的发酵操作决定碳源种类
第二节 氨基酸生产工艺
• 氨基酸是构成蛋白成分
• 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20 多种。
氨基酸
• α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基 和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性 质不同。
氨基酸的用途
• 1.食品工业： • 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小
麦中) • 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 • 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量
• （2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些， 以抑制菌体生长。
• （3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或 不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。
• （4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。
温度对氨基酸发酵的影响及其控制
• 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基 酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合 成的最适温度是不同的。
• 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸 族氨基酸发酵
谷氨酸生产工艺
• 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质 而制取。
• 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投 入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业 的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶 段。
• 目前世界产谷氨酸钠30吨/年，占氨基酸总量的 2/3。
• 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节 元件一起克隆进目标生物;
• 使调节元件的作用及培育条件最优化。
3.1 载体-受体系统及克隆表 达的研究
• 3.1.1 受体的获得
• 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌 K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出 的基础产率较高的菌株。
• 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善， 利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将 蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。
• 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨 酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发 酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发 酵。
2.3 类似物抗性变异株的方法
• 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类 似的化合物加入培养基内，使其发生控 制作用，从而抑制微生物的生长。这样， 就可以得到在这种培养基中能够生长的 变异株，而这种变异株正是解除了调控 机制的，能够生成过量的氨基酸。
• 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的 转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于 稳定遗传。
氨基酸发酵的代谢控制
• 控制发酵的条件 • 控制细胞渗透性 • 控制旁路代谢 • 降低反馈作用物的浓度 • 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 • 促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合
成
控制发酵的条件
• 二、菌种扩大培养
• 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短 杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。
• 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆 菌和北京棒杆菌及各种诱变株。
• 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物 素为生长因子。
• 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成 的pH7.0-7.2琼脂培养基，32℃培养18-24h。
• 4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时 糖代谢受抑制。
• 5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶 和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶活力。
• 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多 利于产酸，钾少利于菌体生长。
• 7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH 值时加入。
• 8、锰：是许多酶的激活剂。
• 专性需氧菌，控制环境条件可 改变代谢途径和产物。
控制细胞渗透性
•生物素、油酸和表面活性剂， 引起细胞膜的脂肪酸成分的 改变。 •青霉素：抑制细胞壁的合成， 由于细胞面内外的渗透压而 泄露出来。
控制旁路代谢
降低反馈作用物的浓度
• 利用营养缺陷型突变株进行氨基酸 发酵必须限制所要求的氨基酸的量。
• 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用
• 大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调 pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85 ℃30min，加糖化酶60 ℃糖化24h，过滤 后可供配制培养基。
• 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发 酵的碳源，因含丰富的生物素。
• 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和 亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在 发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加 中青霉素。
种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和 甜菜糖蜜为来源。
pH对氨基酸发酵的影响及其控制
• 作用机理：主要影响酶的活性和菌 的代谢。
• 控制pH方法：流加尿素和氨水 • 流加方式：根据菌体生长、pH变
化、糖耗情况和发酵阶段等因素决 定。