第七章 抗原抗体反应

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体的先决条件(反过来,所得到的抗体又可以纯化和检测抗原)。抗 原以不同形式和方式刺激机体免疫系统产生以抗体为主的体液免疫 应答或以细胞毒为主的细胞免疫应答。抗原种类繁多,但依其物理 性状可分为颗粒性和可溶性抗原两类。颗粒性抗原多为微生物细胞 (或病毒粒子);其制备相对简单,一般用新鲜细胞经无菌生理盐水 或磷酸缓冲液洗涤后,配制成一定浓度即可。若是细菌H-抗原,则 还需用0.3-0.4%甲醛处理;细菌O-抗原需经100℃加热2h处理后应 用。 1. 动物抗血清(多克隆抗体)的制备 制备动物抗血清涉及到免疫使用的抗原、实验动物、佐剂以及 免疫方法等诸多因素;免疫所用抗原剂量与抗原种类、动物、免疫 周期及所要求的抗体特性等有关。抗原剂量过低不能形成足够强度 的免疫刺激;抗原剂量过高又有可能造成免疫耐受。 供免疫用的实验动物常有家兔、羊,马匹常用于制备大量抗毒 素血清,豚鼠较适于制备抗胰岛素抗体和供补体结合试验用抗体。
试管凝集试验
环状沉淀反应
抗原的定性、法医学鉴定血迹、食品卫生学鉴别肉的种类等。反应 时若将抗原抗体充分混匀,一定时间后可出现絮状颗粒,此称为絮 状反应(检验梅毒的康氏试验即为此法,现已不多用)。 1.3 补体结合试验. 在补体 参与下,以绵羊红细胞和溶 血素为指示系统的抗原抗体 反应。整个试验包括补体和 待检系统以及指示系统。 该法的敏感性和特异性 较高,临床上用于检测梅毒 、L-链、免疫蛋白、抗DNA 抗体、抗血小板抗体、乙型 肝炎表面抗原(HBsAg)…等。
1.4 中和试验. 抗体使相应抗原的毒性或 传染性消失的反应称为Βιβλιοθήκη Baidu和试验。临床上 可用于检测风湿病患者体内的抗链球菌溶 血素O抗体。
2.现代抗原抗体反应 2.1 派生于凝集反应 2.1.1 间接凝集反应. 将可溶性抗原吸附 或偶联于无关颗粒上,使其成为致 敏载体颗粒,然后再与相应抗体结 合并出现凝集现象,这就称为间接 凝集反应。常用的无关载体颗粒包 括Rh-/O型人红细胞、动物红细胞、 活性炭、聚苯乙烯乳胶微球等。
2.1.4 协同凝集试验. 用金黄葡萄球菌作为IgG的载体进行的凝集 反应。金黄葡萄球菌细胞壁成分中 的A蛋白可与人以及许多哺乳动物血 清中的IgG类Fc段结合,而IgG类的 Fab段则可与相应抗原结合而出现凝 集现象。此法已用于流脑、伤寒、布氏杆菌等的早期诊断。
2.2 派生于沉淀反应 2.2.1 单向琼脂扩散. 用抗原在 含有抗体的琼脂中自然扩散,在适 当浓度处会出现沉淀环的方法,这是一种定量试验。沉淀环的直径 与浓度成正比。若用不同浓度已知标样抗原作同样单向扩散并绘出 标准曲线,即可对样品所现沉淀环的直径查曲线得出其抗原含量。
根据Burnet的抗体产生学说, 每株B-细胞系(从一个祖先B细 胞分裂繁殖而形成的细胞纯系 ---克隆系)只能产生一种针对 它所识别的特异性抗原决定簇 的抗体,如无变异,其基因也 是完全相同的。这种从一株克 隆B-细胞系产生的抗体就称为 单克隆抗体(McAb)。 免疫动物常选用BALB/C小 鼠(小鼠的一个品系,来自胚 胎预先感染了白血病病毒的小 鼠),它具有的病毒DNA像一个 单一的孟德尔基因那样传递, 即异合子动物在每个二倍体细胞中具有一个拷贝的病毒DNA,而同合
抗原向阳极泳动,抗体向阴极泳动,于是就形成了对流。该法灵敏 度比双向扩散高10-15倍,但其特异性不及双向扩散。现已有用于 HBsAg和甲胎蛋白(AFP)的初筛。 2.2.4 免疫电泳. 先将抗原在琼脂平板作电泳处理,然后再进行双 向扩散作用的一种分析方法。 抗原样品中各成分按泳电率 和泳动方向的不同而得以分 开;然后在与电泳方向平行 的琼脂槽中加入相应的抗血 清进行双向扩散。此时抗原 抗体会在浓度比例适合的地 方形成可见的沉淀弧。若将 其与已知的抗原抗体所形成 的电泳比较,就可以分析样
2.1.2 间接凝集抑制试验. 将可溶性 抗原先与相应抗体混合,然后加入用抗 原致敏的载体颗粒;由于抗体已经与可 溶性抗原结合而不能再与致敏颗粒上的 抗原发生间接凝集,故称之为间接凝集 抑制。不发生凝集结果者为阳性,反之 就是阴性。临床上的乳胶妊娠试验即为 此法。若用红细胞作致敏载体,则称为间接凝血和间接凝血抑制试 验。 2.1.3 反向间接凝集试验. 将抗体吸 附于载体颗粒上以检测抗原的反应。此 法对检测抗原有较高敏感性,多用于对 传染病和肝病的早期诊断。如是用红细 胞作载体时则称为反向被动凝血反应。
3.参与反应的抗原抗体比例和浓度应适当
抗原抗体相遇时,只要是相对应的, 无论比例浓度如何都会很快发生特异性结 合。但是,只有在一定浓度和二者分子比 例适合时过境时才会出现(肉眼)可见的反 应,如沉淀反应、凝集反应中产生的沉淀 物和凝集块。只要二者比例适当,就可产 生沉淀和凝集块且量大;否则就产生很少 或无法产生沉淀和凝集块。抗原抗体特异 性结合一般可在几秒钟内完成,但要出现可见反应则受到一定条件 影响,除浓度比例外,还需一定的pH、温度、电解质、补体等。出 现可见反应所需时间范围变化较大,短之以秒计,长者以时计甚至 过夜。 4.交叉反应 抗原(抗体)除可与其相应抗体(抗原)发生特异性反应外,还可
用多孔培养板培养二周左右,在有杂交瘤生长的孔内取上清液检 测有无特异性抗体;对有抗体产生的孔内的杂交瘤进行进行有限稀 释以克隆细胞。重复数次以保证抗体确由单克隆细胞所分泌。
第二节 抗原抗体反应原理 体外的抗原抗体反应被称为血清学反应;抗原抗体结合时可因 抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而会出现各种反应现象 。 1.抗原抗体结合具有特异性. 一种抗原分子只能与由它刺激机体所产生的抗体结合而发生反 应;抗原的特异性取决于其抗原决定簇的数目、性质和空间构型。 抗体的特异性则取决于Ig的Fab段可变区与相应抗原决定簇的结合能 力;但是这种结合不是以共价键方式,而是通过较弱的短距离引力 方式,如范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。 2.抗原抗体结合为可逆的化学反应 抗原抗体结合具有高度特异性,且有相当稳定性;但是为可逆 反应。因为两者属非共价结合,可在一定条件下解离;两者结合的 强度在较大程度上取决于抗体Fab段与抗原决定簇主体构型的吻合度 ,若二者适合性良好,则结合紧密,此抗体就称为高亲和力抗体; 反之就是低亲和力抗体。解离后的抗原抗体性质不变。
子个体中有两个拷贝。在它们的组织中产生具有感染力的病毒,90% 的小鼠在10月龄之前就可产生。由胸腺形成的淋巴瘤。单抗制备采 用其B-细胞和骨髓瘤细胞。… 诱导细胞融合可采用生物学(仙台病毒)、物理学(电场、激光诱 导)和化学(聚乙二醇、溶血卵磷脂)的方法;融合后再利用HAT培养 基选择培养(H-次黄嘌呤,A-氨基喋呤,T-胸腺嘧啶)或代谢缺陷补救机理筛选 出杂交瘤细胞。[HAT培养中的氨基喋呤在化学结构上与叶酸非常相似,是叶酸还原
酶的有效竞争抑制物,可阻断嘌呤碱的从头合成途径,使得骨髓瘤细胞不能在这种培养基 中合成DNA而避免其过度生长繁殖。而杂交瘤细胞由于可从免疫脾细胞中获得次黄嘌呤—鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶-HGRPT和胸苷激酶-TK,因而可通过另一途径(或称之为补救途径)利用 次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸,而在HAT培养基中存活,且大量繁殖。]
与其他抗体(抗原)发生相应的特异性反应,这种反应就称为交叉反 应。交叉反应的产生可因抗原的异质性、共同决定簇或决定簇相似 性而引起。
第三节 常见的免疫分析方法
免疫分析方法是抗原抗体特异性反应的特点而对抗原或抗体进 行定量或定性的测定分析方式。免疫分析方法具有特异、灵敏、快 速等特点;如用单克隆抗体进行检测样品时,可表达到一个氨基酸 分子的差异;而ELISA法测定样品的量可达到微克甚至纳克水平。 常用的免疫分析方法包括经典的抗原抗体反应和现代的抗原抗 体反应。经典的免疫分析方法是指在细菌学早期建立起来的四个古 典的血清学方法,即凝集反应、沉淀反应、补体结合试验以及中和 反应。现代的免疫分析方法是在经典方法基础上结合现代技术而发 展起来的各种免疫分析方法,如由凝集反应派生出的间接凝集反应、 间接凝集抑制反应、反向间接反应、协同凝集试验、抗球蛋白
2.2.2 双向琼脂扩散. 用抗原抗体的同一琼脂介质中作相对扩散的 一种方法,即将抗原抗体加入不同 的小孔内,置湿盒内使其扩散,一 定时间后可观察是否有沉淀线,沉 淀线数目及其相互关系。此法需时 长,灵敏度较低,但特异性较高, 常用作定性测定。 2.2.3 对流免疫电泳. 这是双向扩散 与电泳技术结合一种方法。在Ph8-8.6 的缓冲溶液中,蛋白质抗原带负电荷, 可由阴极移向阳极。抗体虽然也是蛋 白质,但其等电点比抗原高,所带阴 离子就少;加上其分子量较大,移动 速度缓慢。同时因电渗作用,抗体反 ①Ag为阳性;②Ag为弱阳性; ③Ag为强阳性 ④Ag为强阳性 而向阴极泳动。所以在电场作用下,
试验等;由沉淀反应派生出的单向琼脂扩散、双向琼脂扩散、对流 免疫电泳、免疫电泳、火箭电泳等;免疫标记技术(包括免疫荧光技 术、酶免疫测定技术、放射免疫测定法、免疫电镜技术、发光免疫 测定法等)。
1. 经典方法 1.1 凝集反应. 颗粒性抗原与相应抗体 在一定条件下出现凝集的现象。反应中的 抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。凝集 反应可在试管、玻片上进行。待测定的抗 原(抗体)经过连续稀释后加入一定量的抗 体(抗原);在反应中当出现明显反应终点 时的抗血清或抗原制剂的最高稀释度称为
根据抗原不同及实验要求,抗原注射信息系统可采用皮下、皮 内肌肉、静脉、腹腔、淋巴结内等不同途径。初次免疫后需经过一 段时间(3-4周)可进行再次或多次免疫,这样可以保持高水平抗体 生成。在免疫加强最后一次注射后的一周内可以采集血清。抗血清 提纯并检验合格后可经56℃30min灭活,再加入适当防腐剂,置低 温(-20℃)保存(可达数月或数年)。 2. 单克隆抗体制备 1975年,Koehler和Milstein 成功应用杂交技术将小鼠的免 疫脾与小鼠的骨髓瘤细胞相融 合,由此产生的杂交瘤细胞传 承了两个亲代细胞的特点,既 保留了骨髓瘤细胞可以人工培 养且具无限增殖的特点,又具 有淋巴细胞(已致敏)合成分泌 特异性抗体的能力。
品中所含成分。该法的优点是样品用量少,特异性高,分辨力强; 但敏感性略差。主要用于分析抗原、鉴定提取物纯度、研究抗体组 成的动态变化等。 2.3 免疫标记技术 指用荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质标记抗体或抗 原而进行的抗原抗体反应。其优点在于特异、敏感、快捷,可定量、 定性,且易于观察。 2.3.1 免疫荧光技术(或荧光抗体法). 用荧光素与抗体结合成荧光 抗体进行抗原抗体反应。该技术由Coons(1942年)首创,常用的荧光 素有异氰酸荧光素和罗丹明[9-(2-Carboxyphenyl)-3,6-bis(diethylamino)xanthylium chloride]。荧光抗体仍然具有结合抗原的活性,结果可用荧光显微镜 检测。荧光免疫技术可分为直接法和间接法及补体法。 ●直接法. 将荧光抗体直接加在已经固定于载片上的标本(组织切 片或涂片)上,作用30分钟,洗去未结合的荧光抗体,干燥后镜检。 该法特异性高,但对于不同抗原均需制作相应荧光抗体(目前已少 用)。
效价(滴度)。如,ABO血型试验(玻片凝 集试验)诊断伤寒、副伤寒的肥达试验 (试管凝集试验)均属此类反应。 1.2 沉淀反应. 可溶性抗原与相应抗 体在一定条件下出现可见沉淀的现象。 反应中的抗原称为沉淀原,抗体称为沉 淀素。沉淀反应也可在试管或玻片上进 行;在试管中进行时,在小口径试管内 先加入已知抗血清,然后小心加入待测 抗原于血清层上形成分界清晰的两层。 反应结果为阳性时,可于数分钟后在两 层液面交界处出现白色的沉淀环,此试 验称为环状沉淀反应。沉淀反应常用于
第七章 抗原抗体反应
授课要点: 1. 抗原抗体反应原理 2. 常见的免疫分析方法
免疫应答的最终结果是免疫应答效应物与抗原性异物相互作用, 其结果或是保护机体免遭抗原性异物的损伤(生理性),或是对自身 组织器官造成损伤(病理性)。免疫效应物包括抗体、致敏淋巴细胞 、补体及其某些细胞因子。由于抗体存在天血清或组织液中,抗原 抗体特异性反应不仅可在体内进行,也可在体外进行;所以抗原抗 体反应就构成了利用血清学方法进行各种检测的基础。 第一节 抗体的制备 抗原抗体是血清学反应的物质基础,且对抗原特异性的抗体是 免疫应答的效应物之一。所以,抗原的获得与纯化是获得特异性抗