第三章 抗体制备

方法简单易行 筛选容量增大 直接得到抗体的基因 可模仿体内免疫过程 可以获得一些用传统方法难于制备的抗体
二、可溶性抗原
蛋白质（糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体和细菌外毒素 ）、多糖和核酸等都是可溶性抗原。
（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
组织细胞抗原的制备：粉碎的方法有两种：高速组织 捣碎机法和研磨法。
细胞可溶性抗原的制备：常用的细胞破碎方法有超声 破碎法、酶处理法、冻融法和表面活性剂处理法。
（二）可溶性抗原的纯化
1.抗原结合片段(Fab) 由一条完整的L链和约1/2的H链 组成，具有与完整抗体相同的抗原结合特性，但只能结合 一个抗原表位。
2.可变区片段(Fv)和单链抗体(ScFv) Fv是抗体分子 中保留抗原结合部位的最小功能性片段，是由VL链和VH链 以非共价键结合而成的单价小分子，为完整抗体的1/6。
一、人源化抗体
人源化抗体(humanized antibody) 是指利用基因 克隆及DNA重组技术对产生鼠源McAb的杂交瘤细胞内抗 体基因进行改造，使其分泌的McAb中大部分氨基酸序列 为人源序列所取代，既保留了亲本鼠McAb的特异性和亲 和力，又降低了其异源性，以利于临床应用。
人-鼠嵌合抗体（human-mouse chimeric antibody ） 是利用DNA重组技术，从杂交瘤细胞中分离出鼠源 McAb功能性IgV区基因，与人IgG C区基因连接成嵌合基 因后， 插入适当的表达载体中，构建人-鼠嵌合的重链 和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞中表达的抗体 。
2.增强机体对抗原刺激的反应性，提高机体初次和再次 免疫应答产生抗体的效价。
3.促进抗体类型转换，使产生的抗体由IgM转变为IgG。 4.引起或增强迟发型超敏反应。
三、佐剂的作用机制
1.改变抗原物理性状，延缓抗原降解，延长抗原在体 内的停留时间，从而有助于抗原提呈细胞(APC)对抗原的 摄取。
2.诱导产生炎症反应，吸引APC到达炎症感染部位并 使之活化,增强APC对抗原的加工和提呈。
含Fab段或Fv的抗体融合蛋白 将Fv与某些毒素、细胞 因子及酶等的基因拼接，通过Fv的引导可将其生物活性物 质导向靶细胞特定部位，更有效地在局部发挥生物学功能 而降低毒副作用。
含Fc的抗体融合蛋白 将某些功能性蛋白分子与抗体 Fc段融合可产生两种效果:①延长该蛋白在体内的半衰期； ②通过功能性蛋白与其配体的作用，将抗体Fc段的生物学 效应引导至特定的目标。
3.重链抗体（heavy chain antibody, HcAb） 是 指缺失L链的H链同型二聚体。
通过基因工程可以获得保留抗原结合活性的重链抗 体可变区，也称为单域重链抗体（single domain heavy chain antibody,sdHcAb）。
重链抗体以其分子量小，稳定性高，免疫原性弱， 组织穿透力强，可以结合一些常规抗体无法接近的抗原 表位等特点，显示出其与常规抗体相比在抗体-抗原结 合及免疫防御中的优势。
半抗原不能直接用作免疫原，只有把半抗原与蛋白质 等大分子物质结合后，才能剌激机体产生抗体或致敏淋巴 细胞。
半抗原-载体的连接方法： 带有游离羧基或游离氨基以及两种基团均有的半抗原 带有羟基、醛基和酮基的半抗原 芳香族半抗原
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂( immunoadjuvant)是指预先或与抗原同时 注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答 类型的非特异性免疫增强性物质。
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因或可变 区基因，获得全部的Ig的cDNA文库。
利用噬菌体展示技术，使Ig在噬菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ -球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
第一节 免疫原的制备
免疫原（immunogen）是能刺激机体免疫系统产生特 异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
在抗体制备过程中，多种因素能够影响所制备抗体的 质量，但高质量的免疫原是制备合格抗体的前提条件。
一、颗粒性抗原
颗粒性抗原主要包括人和各种动物细胞抗原、细菌抗 原和寄生虫抗原等。常用的抗原为: 绵羊红细胞、细菌抗 原和细胞膜抗原。
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
噬菌体抗体库（phage antibody library）技术就 是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变 区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上 并以融合蛋白的形式表达在噬菌体外壳表面。
噬菌体抗体库分为3种： 天然抗体库(naive library) 免疫抗体库(immune library) 合成抗体库(synthetic library)
五、噬菌体抗体库技术
抗体库技术（antibody library）是将某种动物的所 有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同 的抗原筛选出携带特异性抗体基因的克隆，从而获得特异 性的抗体。
抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破①PCR技 术的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫 球蛋白可变区基因；②利用大肠杆菌成功表达出具有抗原 结合功能的抗体分子片段。
兔单克隆抗体
兔McAb在ELISA试验和免疫组化（IHC）中拥有更高的 亲和力和特异性。
兔McAb能够以识别许多在小鼠中不产生免疫应答的抗 原。
由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高 通量筛选融合细胞成为可能。
与鼠McAb的人源化相比，兔McAb的人源化更容易。
四、单克隆抗体纯化
预处理常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法。 纯化方法：一般采用盐析、凝胶过滤、辛酸提取和离子 交换层析等方法进行纯化。 最有效的McAb纯化法为亲和层析法。 常用SPA或抗小鼠Ig抗体与琼脂糖交联，制备亲和层析 柱将抗体结合后洗脱，可获得高纯度的单抗。
为进一步降低抗体的免疫原性，人们应用基因工程技 术将鼠源McAb中互补决定区(complementarity determining region，CDR)移植至人源抗体可变区，替代 人源抗体CDR，即为CDR植入抗体。
二、小分子抗体
小分子抗体是指分子量较小但具有抗原结合功能的分 子片段。
优点表现为:分子量小、 可在大肠杆菌等原核细胞中 表达、免疫原性要比原来的McAb弱得多、不含Fc段有利于 作为靶向药物的载体、半衰期短、周转快有利于放射免疫 成像检查肿瘤。
一般采用的纯化方法有超速离心法、选择性沉淀法、 凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。
（三）免疫球蛋白片段的制备
免疫球蛋白片段的制备方法有解离二硫键、溴化氰裂 解法和酶裂解法。
三、半抗原
半抗原（hapten）是指只有抗原性而无免疫原性的物 质，如多肽、多糖、甾族激素、核苷、某些药物以及其他 化学物质等。
二、杂交瘤细胞的制备过程
亲本细胞的选择和融合 选择培养基的应用 抗原特异性杂交瘤细胞的筛选
三、单克隆抗体的生产
大量制备单克隆抗体的方法主要有两种，一种是动 物体内诱生法，另一种是体外细胞培养法。
动物体内诱生法 是目前McAb大量制备的主要方法。 体外细胞培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行 培养。 兔单克隆抗体
抗原的注射剂量应考虑抗原的免疫原性的强弱、分子 量大小、动物的个体状态和免疫时间。
三、免疫程序
动物产生抗体的过程符合抗体产生的一般规律—即初 次免疫应答和再次免疫应答的规律。一般在首次接触抗原 7天～10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14天～21 天内达到高峰，随后开始下降。
通常首次免疫后3周左右进行加强免疫，加强免疫至 少2次，必要时需3次～5次。
一、佐剂的种类
主要包括：生物性佐剂、无机化合物佐剂、人工合成 佐剂。
弗氏佐剂（Freund adjuvant,FA）可分为:弗氏不完 全佐剂、弗氏完全佐剂。
佐剂与抗原混合乳化的方法有两种：研磨法、搅拌混 合法。
二、佐剂的生物学作用
1.增强抗原免疫原性，使无或弱免疫原性的物质成为持 久或强免疫原。
三、双特异性抗体
双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)是指同 时能与两种不同特异性的抗原发生结合的抗体。它不同于 天然抗体，其两抗原结合部位具有不同的特异性。
（一）双特异抗体分子的构建
1.双特异抗体分子片段的体外构建 利用一个二 聚化结构域将两个ScFv组装成一个异二聚体分子，例如 亮氨酸拉链(leucine zipper) 为二聚化结构域可连接 两个小分子抗体。
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体（McAb）的特点是理化性状高度均一、纯 度高、特异性强、少或无血清交叉反应的特点，易于实验 标准化和大量制备。
五、单克隆抗体鉴定
抗体效价测定 抗体特异性鉴定 Ig类型鉴定
六、单克隆抗体的特性
高度特异性 高度均一性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 细胞毒作用较弱 对环境敏感性
七、单克隆抗体的应用
临床检验诊断试剂 蛋白质的纯化 肿瘤的导向治疗 放射免疫显像技术
第五节 基因工程抗体及应用
基因工程抗体（genetic ห้องสมุดไป่ตู้ngineering antibody ）又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术 对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配 ，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。
第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第三章 抗体制备
王辉
目录
第一节 免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 第三节 多克隆抗体的制备及应用 第四节 单克隆抗体的制备及应用 第五节 基因工程抗体及应用
抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性免疫应答的 重要产物，也是免疫学实验中的常用试剂，对于抗原的分 析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学实验室诊断中 广泛应用。
3.刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答。
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌 特异性抗体能力的致敏B细胞与具有无限繁殖能力的骨髓 瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有两种亲代细胞的特性，既保留了 骨髓瘤细胞在体外培养无限增殖的特点，又继承了致敏B 细胞可合成和分泌特异性抗体的能力。
杂交瘤技术使用的选择培养基是在普通细胞培养液中 加入次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨基喋呤（aminopterin,A ）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字头称 为HAT培养基。
2.双特异抗体分子片段的细胞内组建 通过对小分 子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双特异抗体分 子，较体外组建更为简便有效。
（二）双特异性抗体的应用
在免疫检测中的应用 在肿瘤放射免疫显像中的应用 双特异性抗体介导的药物杀伤效应 双特异性抗体介导的细胞杀伤效应
四、抗体融合蛋白
抗体融合蛋白(antiteody fusion protein)是指 利用基因工程方法重组表达的抗体片段与其他生物活 性蛋白融合的产物。