植物转基因技术原理及要点

例 Gus检测
原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催 化β－葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解 产物具有发色团或形成荧光物质。 例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为X-gluc,产物是一种不可溶的5,5二溴，4,4-二氯靛蓝；
转基因植物的PCR检测
外源基因整合的PCR-Southern杂交检测 外源基因拷贝的IPCR检测 外源基因表达的RT-PCR
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电击法的主要原理是将原生质体
在溶液中与DNA混合,然后利用高 压电脉冲作用,使原生质体膜的某 些部位被击穿而产生可回复的小 孔,外源DNA可通过小孔进入原生 质体内,而且不影响经电击处理的 原生质体再生植物的能力.
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花粉管通道法是利用开花植物授粉
后形成的花粉管通道,直接将外源目 的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、 合子或早期胚胎细胞,实现目的基因 转化.
带有转化基因的农杆菌活化
共培养 侵染 叶盘 受体植物
诱导成苗
遗传转化主要的影响因素：
1.预培养时间：一般0~3天，过长不利于侵染 2.农杆菌浓度：用MS（pH=7.0）盐溶液调OD值（一般在 0.2~1.0） 3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆 菌难以除净，毒害材料。 4.共培养时间 5.乙酰丁香酮（AS）处理：处理方式及浓度 (A) 仅共培养基中加AS (B) 仅菌液中加AS 实验结论：A与C效果最好且差异不明显 (C) 菌液和共培养基中均加AS AS使用浓度：50μM~200μM
转基因方法
DNA间接转化法 农杆菌介导基因 转移
转化的优点
转化的缺点
受体种类，可以在原生质体、 转化双子叶植物为主。大 蛋细胞和细胞团、组织器官 多数单子叶植物和裸子植 或整株等多级水平上进行， 物对农杆菌的侵入不敏感， 方法成熟可靠，简便易行， 限制了该法在禾谷类作物 周期短，转化率高； 中的应用。 转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞
DNA直接转化法
无宿主限制，适用于各种单、 转化效率低，需要专门设 备（电击仪、显微操作仪 （1）基因枪转化法 双子叶植物，操作简单 或基因枪），多数需要原 （2） 电击法 生质体与愈伤组织，周期 （3） PEG介导基 太长（电击法） 因转化法
（4）花粉管通道法
5.转化组织 ——农杆菌介导之叶盘转化法
(Agrobacterium tumefaciens),
是一种革兰氏阴性土壤杆菌,
它含有Ti质粒,能诱导被侵 染的植物细胞形成肿瘤, 即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移 DNA,在农杆菌侵染宿主 植物时,这段DNA可以转 移进植物细胞,并稳定地 保留在植物细胞染色体中, 变为植物细胞新增加的一 群基因,最终能通过有性 世代遗传给子代 。
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PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇
(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高 pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分 子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连, 并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间 的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进 入原生质体.
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表1 几种植物转基因方法比较
6.炼苗
7.转基因苗的筛选与鉴定
培养过程中利用标记基因筛选
选择标记基因(Slective gene)
抗生素类选择基因 抗除草剂类选择基因 生物安全性标记类选择基因 ……
标记基因
报告基因(Report gene)
β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) ……
杂交鉴定
外源基因整合的Southern 杂交鉴定 外源基因转录的Northern杂交检测 外源基因表达蛋白的检测 外源基因整合及表达的原位杂交检测
Southern杂交过程
8.转基因植物成果检测
Thank you !
植物转基因技术原理及要点
李琳玲
1.技术路线
目的基因分离 植物表达载体的构建
遗传转化
受体材料的准备 转化组织
炼苗
转化植株筛选
组织脱分化
1.目的基因的分离


（1）已知基因的获得
①化学合成法 ②PCR扩增


（2）未知基因的获得
①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……
CaMV35P
chs
β-glucuronidose
NOS ter
wk.baidu.com
3.受体材料的准备 细胞的全能性：分化细胞脱分化
再分化
4.遗传转化
（1）间接转化法——农杆菌介导转化法
（2）直接转化法
A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法
根癌农杆菌
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基因枪转化法由美国Cornell大学的
Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包 含目的基因的载体包被在微小的金属微 粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加 速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细 胞内,然后通过组织培养再生出完整的植 株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到 染色体上并得到表达,从而实现基因的转 化.。


2.植物表达载体的构建
④
pGEM-T
⑤
⑥ ⑥
① ②
①银杏叶RNA提取 ②反转录cDNA ③chs全长cDNA的克隆 ④TA克隆及测序
③
⑦
⑤向chs两端引入酶切位点 ⑥双酶切 ⑦定向克隆 ⑧导入农杆菌
⑧
例 pBI121-chs构建
pBI121图谱
银杏chs基因植物表达载体构建示意图
chs