芦丁的提取(华西药学药化实验)

9.制备苷元五乙酰化物。称取0.20g苷元纯品于25ml圆底烧瓶中，加入6ml醋酐和一滴浓硫酸，振 摇，80-90摄氏度油浴加热30min，随着加热的进行，固体逐渐溶解，得棕红色澄清溶液，放 冷。搅拌下倾入100ml冰水中，搅拌至油滴消失，析出灰色固体，过滤，得浅咖色固体小颗粒。 用16.5ml95%乙醇加热回流溶解制成饱和溶液，再2.5ml （抛加15%-20%），趁热抽滤除去不 溶性杂质，滤液用冰水浴静置后抽滤除去可溶性杂质，得白色固体，红外灯下干燥，称重，测 定熔点，描述形状并计算产率。结果如下：
药材：豆科槐属植物槐树（Sophora japonica L.）花蕾。 试剂：浓盐酸、Mg粉、1%AlCl3乙醇溶液、3%FeCl3乙醇溶液、 10%α-萘酚、浓硫酸、硼砂、新鲜石灰乳、2%硫酸、95%乙醇、 水、BaCO3细粉、ZrOCl2溶液、枸橼酸、鼠李糖标准品溶液、葡 萄糖标准品溶液、醋酐、GF254、0.5%CMC-Na溶液、芦丁标准品 溶液、槲皮素标准品溶液、纸层析展开剂（正丁醇-乙酸-水比例为 4:1:5）、纸层析显色剂（苯胺-邻苯二甲酸试剂）、薄层层析展开 剂（氯仿-甲醇-加酸比例为15:5:1）、薄层层析显色剂（1%FeCl31%Fe（CN）6比例为1:1）。
槐花米中芦丁的提取分离与鉴定
目的要求： 1.掌握黄酮（苷）类化合物的预试及预试原理。 2.掌握黄酮（苷）类化合物的提取原理和方法。 3.掌握黄酮（苷）重结晶精制的原理和方法。 4..掌握黄酮苷类化合物酸水解操作原理和方法。 5.掌握纸层析、薄层层析定性分析的原理和方法。 6.掌握乙酰化反应制备乙酰化物的原理和方法。 7.了解熔点测定的意义。掌握熔点测定的原理和操作方法。 8.巩固抽滤、重结晶等基本操作。 9.掌握苷类成分的一般鉴定程序。
3.将烘干的产品称重，描述形状并计算产率。结果如下：
名称：黄酮苷纯品 性状：黄色片状 重量：1.92g 产率：12.8% 4. 称取所得的黄酮苷纯品1.00g，稍加研碎后转入150ml圆底烧瓶中，加入 80ml2%硫酸，保持微沸1h，
现象 溶液颜色变化为淡黄色-黄色加深橙色，并伴有溶液逐渐澄清；橙色又 变为黄色，并出现大量黄色小颗粒。 结论 黄酮苷在热水中的溶解度比冷水 中大，随着加热而溶解，溶液变澄清； 黄酮苷经酸水解后分解产生不溶于水 的黄酮苷元，溶液变浑浊。
7.熔点测定的原理及意义：物质自初熔至全熔的温度范围称熔距或熔程。若将毛 细管与温度计的水银球紧密靠在一起，则毛细管内被测物质的温度可从温度 计上直接读取，这样就可以测出被测物质初熔和全熔时的温度，从而计算出 熔距，再与其标准熔距比较，就能鉴别被测物质的纯度，因为纯净的有机物 有固定的熔点，熔距很小，仅为0.5～1.0℃，若被测物质含有少量杂质，熔 点一般会下降，熔距显著增大。通过测定熔点可以鉴别未知纯粹固态化合物 并可根据熔距的长短判断化合物的纯度。
重叠处黄色加深，且在 紫外下有荧光
检品中可能含有黄酮类 化合物，且可能含以下 三种结构
草绿色
可能含 酚羟基
总结论 2.
检品中可能含有黄酮苷类化合物
将1.03g硼砂加入300ml沸水中搅匀后，把研碎后的其余槐花米粗粉（15.00g） 加入其中，立即用新鲜石灰乳调至PH 8，保持此PH微沸30min（需不断补充蒸 发掉的水分）。趁热用尼龙布拧挤过滤，得咖啡色滤液250ml，滤液在60-70摄 氏度下用浓盐酸调至PH4，放置一周。小心倾倒上清液，抽滤，得泥黄固体， 用约230ml沸水将其溶解（逐加法）至饱和，再多加25ml沸水（抛加10%-20% 溶剂）以防止热过滤过程中由于温度降低析出固体。溶解过程中溶液颜色变化 为：淡黄色浑浊—棕红色微浑浊。趁热过滤除去难溶性杂质，滤液静置自然冷 却，抽滤除去易溶性杂质，得淡黄色固体，洗涤，干燥。
现 黄酮 象 苷醇 液 黄酮 苷元 醇液 结论
HCl+Mg粉
红色
Molish试剂
有红色环
ZrOCl2/H+试剂
黄色较浅，加入枸盐酸后黄色褪去
红色
无红色环
黄色较深，加入枸橼酸后黄色稍变浅
苷及苷元都是 黄酮类化合物
黄酮苷在酸水中 发生了水解
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黄酮苷元分子中有游离的3-OH和5-OH，而黄酮 苷分子中只有游离3-OH；苷元的3-OH与糖脱水 形成苷键。
E.锆-枸橼酸反应：黄酮类化合物分子中有游离的3-OH或5-OH存在时，可与锆盐 （ZrOCl2）反应生成黄色的锆络合物，但两种锆络合物对酸的稳定性不同， 3-OH、4-酮基络合物的稳定性比5-OH、4-酮基络合物的稳定性强，因此当继 续加入枸盐酸后，5-OH黄酮的黄色溶液显著褪色而3-OH黄酮溶液仍呈鲜黄 色。
8.称取GF254 2.00g，加入6ml0.5%CMC-Na，混匀，铺板四块并活化烘干。分别取少量苷和苷元 于小试管中，加约3ml95%乙醇，60摄氏度水浴2h，供薄层层析点样用。取上述自制样品乙醇 液和标准品溶液进行薄层层析，层析条件（展开剂：氯仿-甲醇-加酸比例为15:5:1 显色剂： 1%FeCl3-1%Fe（CN）6比例为1:1），结果如下： 样点名称 槲皮素标准品 黄酮苷元样品 黄酮苷样品 芦丁标准品 比移值Rf 0.74 0.74 0.12 0.11 0.01 比移值差Rf 0 结论 提取所得的黄酮苷很可能为芦丁，黄 酮苷水解苷元很可能为槲皮素
冷水浴冷静置，抽滤，得黄色固体（粗制苷元）和浅黄色澄清滤液（糖液）。 5.固体用水至中性，用40ml乙醇-水（1:1）混合溶剂加热回流溶解制成饱和溶液， 再抛加8ml（15%-20%）。趁热过滤除去不溶液杂质，滤液用冰水浴静置后 抽滤除去可溶性杂质，得苷元纯品，干燥，称重，描述形状并计算产率。结 果如下：
B. 乙醇回流法 —— 工艺流程：样品粉碎→加一定浓度的乙醇（固液比一定）→加碳酸 氢钠→在设定温度加热回流→过滤→浓缩→加盐酸调ph→加水静置12h→过滤→干 燥→粗芦丁→煮沸5min→过滤→静置→析出芦丁→过滤洗涤→纯化芦丁 最佳工艺条件： 用乙醇水溶液提取芦丁,体积分数为70％的乙醇溶液用量为原料质 量的25倍,提取温度70℃,时间3 h。 C.热水提取法——工艺流程：样品→ 粉碎→加蒸馏水浸提两次→ 合并提取液→减压浓 缩→ 芦丁提取液 最佳工艺条件：加水量为原料质量的10倍，提取温度为70℃,时间2.5 h。 D. 纤维素酶法——工艺流程：样品→粉碎→加蒸馏水→浸提两次→合并提取液→减压 浓缩→芦丁提取液 最佳工艺条件：酶解温度45℃，PH值 4.5，纤维素酶添加量0.03%，酶解时间2.0h， 料液比1：55。
思考： 1 芦丁提取过程中加入硼砂水的作用：既能形成硼酸/硼酸钠缓冲对从而达到稳 定调节溶液PH，又能保护芸香苷分子中的邻二酚羟基不被氧化，亦保护不与 钙离子络合，使芸香苷不受损失。实验证明，提取芦丁时加入硼砂，产品质 量较好。 2.用石灰乳调PH即可达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中大量的 黏液质和酸性树脂。 3.槐花米粗粉中含有水解芦丁的酶，为防止酶将苷键水解，我们将槐花米粗粉投 入沸水中破坏其中的酶的活性而不是将其投入冷水中加热煮沸。 4. 芦丁的提取方法及其优缺点比较。 A. 碱提酸沉法——工艺流程： 样品粉碎→加蒸馏水→加4%硼砂→加饱和石灰 水调ph→ 微沸提取→ 过滤→ 第二次提取→ 合并滤液→ 加12%盐酸调ph → 静置24小时→ 过滤 →干燥→ 粗芦丁→煮沸5min→过滤→静置→析出芦丁→ 过滤洗涤→纯化芦丁 最佳工艺条件：槐花中芦丁提取最佳pH值的实验研究优化从槐花中碱提取和 酸沉淀的最佳pH值,以提高芦丁的提取效率。在不同pH值的石灰水及盐酸条 件下,通过碱提取酸沉淀法从槐花中提取芦丁。研究发现碱提取pH 9、酸沉淀 pH 3时,提纯率可达18.1％。
名称：黄酮苷元纯品 性状：黄色固体 重量：0.41g(理论产量：0.495g) 产率：83% 6.取20ml糖液用7.10gBaCO3细粉中和至中性，
现象 原因
BaCO3细粉加入即产生大量气泡；PH 调至终点时得黄色浆状物
BaCO3+H2SO4——BaSO4+CO2+H2O
抽滤，得澄清滤液，水蒸汽浴加热浓缩至2-3ml，供纸层析检识用。 取糖液与葡萄糖标准品、鼠李糖标准品进行纸层析，结果如下：
操作： 1. 称取15.5g槐花米粗研碎破壳。取0.5g研碎后的粉末加10ml95%乙醇于70摄氏 度水浴15min，过滤，取滤液进行预试反应，结果如下：
显色试剂
Molish试剂
Mg+HCl
AlCl3
FeCl3
现象
分结论
两界面有棕色环
检品中可能含有 糖或苷类化合物
红色
检品中可能 含有黄酮类 化合物
原理：
1. 碱提酸沉芦丁：芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶 于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉碱溶酸沉碱溶酸沉碱溶酸沉 的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重 结晶精制2.显色反应：黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及γ-吡喃 酮环有关。 A.Mg粉-HCl反应：此为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应，多数黄酮类化合 物显玫瑰红色。 B.AlCl3反应：黄酮类化合物或（）等结构可以和Al3+生成黄色络合物，且在紫 外下可观察到荧光。 C.FeCl3反应：黄酮类化合物中因含有酚羟基，故可产生阳性反应。 D.Monish反应：苷在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水产生糠醛及其衍生物，糠醛 及其衍生物与α-萘酚作用会形成紫红色复合物，因此在糖液和浓硫酸界面有 紫环出现。
注意事项： 1. 本实验的关键点在于PH的调节。碱提取时碱液浓度不宜过高，以免在强碱 性下，尤其加热时破坏黄酮母核；酸化沉淀时酸性也不宜过强，以免生成 羊盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解从而降低产品收率。 2. 重结晶制备饱和溶液时要把握好溶剂的量，一般是先配成饱和溶液，再抛 加15%-20%溶剂。是否已配成饱和溶液要在近沸点时观察。（本实验利用 芸香苷在沸水中的溶解度很大） 3. 芸香苷在碱液中的溶解度随温度变化很大，要趁热过滤。抽滤时要注意观 察抽滤的速度，速度过慢则应分多次进行。未过滤的液体在置于电炉上保 持微沸。 4. 制备苷元五乙酰化物时各装置要干燥。醋酐具有腐蚀性，小心取用。 5. 熔点测定前样品要充分干燥（杂质水分会影响会使熔点降低，熔距增大） 并研细，装填要紧实，装样量约2-3mm。 6. 注意观察初溶温度，即出现第一滴液滴时的温度。
名称：苷元五乙酰化物 形状：白色粉末 重量：0.20g （理论产量0.399g） 产率：50% 熔点：MP.190摄氏度-192摄氏度 191摄氏度-192摄氏度（文献值MP.192摄 氏度-194摄氏度） 结论：从两次熔点测定值得准确度和精密度分析可知，苷元乙酰化物中含有少 量杂质，且苷元可能为槲皮素。 10.综上可得，槐花米中提取物可能为芦丁，其水解产物可能有葡萄糖、鼠李糖、 槲皮素。
样点名称 葡萄糖标准品 样品点1 样品点2
比移值Rf 0.09 0.11 0.30
比移值差Rf 0.02 0.02
结论 糖液中可能含葡萄糖和 鼠李糖
鼠李糖标准品
0.28
7.分别取少量黄酮苷纯品、黄酮苷元纯品，分别加5ml95%乙 醇，70摄氏度水15min，进行苷及苷元的定性反应，结果 如下：
试剂
2.重结晶：重结晶通常用于杂质含量在5%以下的产品的纯化，是利用样品和杂 质在不同温度同一溶剂中溶解度的不同来达到纯化目的。溶剂要求在温度较 低时对所需成分溶解度小而在温度高时对所需成分溶解度大，即样品在该种 溶剂中的溶解度随温度变化很大。 3.槲皮素提取分离：本实验是根据槐花米中芦丁经酸水解成游离的槲皮素和糖， 而游离槲皮素不溶于水而以沉淀析出，可经过滤分离。再利用槲皮素易溶于 乙醇的性质可对其重结晶精制。 4.纸层析法：纸层析是一种分配层析。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动 相为不与水相溶的有机溶剂，混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂 中分配系数差异导致各组分移动距离不同，通过与标准样比对可进行定性分 析。 5.薄层层析：使利用硅胶对样品中各成分吸附能力的不同以及展开剂对它们解吸 附能力的不同，使各成分离，再可通过与标准品的比对达到定性鉴别的目的。 6.槲皮素五乙酰化物制备：反应方程式见报告。