膜片钳技术的发展与应用
崔梦梦
（生命科学学院 1241410026）
摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录
单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨
率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离
子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其
电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与
其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物
学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。
关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用
在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。
随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
一、膜片钳技术的基本原理
膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。
二、膜片钳技术的改进与新进展
（一）穿孔膜片钳技术
1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.4—0.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电
流的衰减现象减弱。并且抗生素对细胞的损伤作用小，高阻封接不易被破坏，记录的持续时间延长。
这种技术需要在避光条件下配制含有抗生素的穿孔液，配好后于4℃避光保存。充灌电极时，先用不含抗生素的电极液充灌，然后再加入含有抗生素的电极液反向充灌电极。在这个过程中，应快速形成高阻封接，避免抗生素扩散到电极尖端抑制高阻封接的形成。
（二）在体膜片钳技术
在体全细胞记录膜片钳开始于研究感觉系统对外界刺激的反应特性和机理，因为这在离体标本上几乎是无法实现的。早期研究感觉系统的活体动物实验大多使用细胞外记录方法，这可以研究细胞对自然刺激如光，声音等的反应特性和规律，但不能涉及感觉信息处理的机制。这是因为细胞外单细胞记录只能得到一个细胞的最终输出，即动作电位，而不能获得其突触电位的波形，也忽略了所有的阈下反应。早期膜片钳记录的标本大多为急性分离的细胞，到20世纪80年代末，脑片全细胞膜片钳技术出现，20世纪90年代一些实验室在借鉴脑片膜片钳技术的基础上，尝试在整体动物( 一般是麻醉状态) 上进行膜片钳记录。最早的报道是Pei等在德国马普研究所的工作。他们通过对成年猫视皮层神经元进行全细胞记录，然后观察来自不同方向的光刺激所对应的突触后电流反应，以此探讨视觉信号传递和形成机制，以及视皮层神经元功能和结构的关系。但可能是由于电极与细胞膜的封接不够好，记录到的细胞静息膜电位绝对值较小，动作电位的幅度也比正常值低很多。随后许多国家都开始了对在体膜片钳技术的研究。目前该技术越来越成熟，记录到的反应也越来越符合实际。
（三）全自动膜片钳技术
传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究，全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题。全自动膜片钳技术是离子通道检测的新技术，它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。与传统的膜片钳技术相比，它主要具有以下优点：效率高，是传统膜片钳效率的20—300倍；不需要专业电生理人员，简单易用，所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成，无须显微防震系统；大部分仪器的封接质量在1G欧以上；部分仪器同时适用于研究配体门控通道和电压门控通道；主要应用于药物药理和毒理测试；在药物微量加样设计方面表现优秀；仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。
随着基因组测序的完成和蛋白质组学的兴起，离子通道在未来的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与此同时，作为离子通道研究的最佳伴侣—全自动膜片钳技术将会越来越重要，而且其应用领域也将越来越大。
三、膜片钳技术的应用
（一）在心脏电生理方面的应用
人类心脏主要存在Na+通道、K+通道等主要的离子通道。心脏的自发节律性是受
心肌细胞的电活动控制的，而心肌电活动的基础便是心肌细胞的各种离子电流的变化。因此膜片钳技术可以用来分析心肌静息电位及其自发去极化的机制，对钠、钾、钙和乙酰胆碱通道的调控机制进行更深入的了解。此外，膜片钳技术也可以用来分析心脏在病理状态下引起通道活性和受体功能改变，从而可以从根本上对各种心脏病进行诊断和治疗。
（二）在血管研究中的应用
研究发现血管平滑肌细胞的凋亡与K+通道活动增加有关，在动脉粥样硬化发生与发展过程中，电导型钙激活钾通道起着重要的功能作用。某些药物影响动脉粥样硬化血管平滑肌细胞离子通道而发挥作用。膜片钳技术给动脉粥样硬化发病机理研究带来了新的亮点。
Wiecha等应用膜片钳技术对冠状As斑块平滑肌细胞与正常冠状动脉平滑肌细胞的特性进行了比较研究。结果表明冠状As斑块平滑肌细胞BK Ca比正常冠状动脉平滑肌细胞BK Ca有较高的通道活性。这一发现意味着BK Ca通道在动脉粥样硬化的发生与发展中起着重要的功能作用。
(三)在神经科学中的应用
应用膜片钳技术可以研究神经信号的产生和传导。由于中枢神经系统的脆弱性和难以接近性，研究脑的网络特性及其复杂的调控功能是十分困难的。在具有简单网络系统的离体脑片上应用膜片钳技术，为这一方面的深入研究开辟了一个崭新的领域。
目前将膜片钳技术应用到神经系统的研究是不少的。但主要侧重于用膜片钳技术观察不同部位细胞形态学和电生理特性的研究；各种化学药物的作用对神经系统影响的研究；适于膜片钳技术研究的细胞的制备及分离方法。
（四）在药理学中的应用
药物研制的关键在于探测药物作用的靶点。在药物筛选中，将目的药剂以吹打或灌注方式直接施加于培养细胞。借助特定离子通道阻断剂，利用膜片钳方可迅速判明药物作用及作用方式等问题。因此，膜片钳对于药品的研制、生产都有着十分巨大的促进作用。
制药企业还可以利用当前新兴药物虚拟筛选技术进行初筛，把初筛结果再结合全自动膜片钳技术进行实验上的验证。虚拟筛选的目的是从数十万到数百万化合物库中筛选出可能的小分子化合物，再进一步进行实验研究。把全自动膜片钳技术结合以离子通道为靶标的高通量虚拟筛选研究技术，无疑将会极大的缩短研究时间和节省大量的研究经费。
除此之外，膜片钳技术还可以应用于胃肠道研究、信息传递、中药理论等多个理论中。总之膜片钳技术以其实用、快速、灵敏、准确及重复性好等技术优势已经在大量的研究中得到证实。膜片钳技术为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性、选择性等膜信息，提供了最直接的手段，使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个崭
新的阶段。
四、膜片钳技术与其他技术的结合
随着科学的发展，越来越多的研究需要多种技术的配合运作。虽然膜片钳技术有很强的记录分析功能，单纯应用仍远不足以研究、解释生命活动的许多现象。因此，出现了与其它技术的结合运用。
（一）膜片钳技术与分子生物学技术的结合
分子生物学是从分子水平上研究生物的形态结构及其功能的科学，膜片钳技术利用微电极来研究细胞膜上离子通道的通透性和电位的变化，二者之间的结合，可以将神经细胞离子通道的结构特性和物理特性展现出来。同时，可在同一细胞中分离提取特异性表达的mRNA。用膜片钳进行全细胞记录的同时，收集细胞胞浆，然后将mRNA反转录成cDNA，并进行PCR扩增，将PCR产物通过凝胶电泳和DNA序列进行分析。再用特异性引物来区别离子通道亚单位，揭示神经细胞结构和功能的关系，从基因水平研究神经传导通路，提高对神经系统本质的认识。
（二）膜片钳技术与荧光技术的结合
一些荧光探针常用于检测细胞内的钙离子浓度，它们能与钙离子结合，产生较强的荧光，通过膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度，钙离子的释放及内流等情况，研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。
（三）膜片钳技术与碳纤电极局部电化学微量检测技术的结合
如果给碳纤电极一个适当的稳定的电压，使接近或吸附到碳纤电极表面的某些物质发生氧化反应而释放出电子，碳纤电极可俘获这些电子，而电子流过电极产生电流，因此根据所控测部位或培养细胞中某物质氧化时所产生电流的不同，可判别分泌物(被探测物)的种类，并根据电流总量的大小，计算出该物质的分泌量。1992年，Neher实验室首次将膜片钳膜电容检测与碳纤电极联合运用；1994年又将光电联合检测与碳纤电极局部电化学微量检测技术结合，既能研究分泌机制，又能鉴别分泌物质。
总之，随着膜片钳技术的进一步完善以及与其他先进技术的结合，使其应用领域越来越广泛，相信随着研究的深入，其在生命科学领域中的应用将会大放异彩。
五、对膜片钳技术的展望
膜片钳技术自建立以来，不断的发展完善，对生命科学的研究做出了巨大的促进作用。对该技术的应用已经涉及到神经科学、心血管科学、药理学等多个领域。在体膜片钳技术与全自动膜片钳技术的发展使神经科学以及多细胞的研究等领域展开了新的局面。同时随着科学技术的发展与进步，使得膜片钳技术与其他先进的研究技术相结合，从而将膜片钳技术的应用带入到另一个高峰，在生命科学的研究领域中得到更广泛的应用。
随着膜片钳技术在生命科学领域的大放异彩，个个研究机构都开始对膜片钳技术进行或多或少的研究，并且将其应用到各个不同的领域，使膜片钳技术得到了更充分的发展与应用。
相信在不久的将来，膜片钳技术必将为生命科学的发展做出更重要的贡献。
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姓名：崔梦梦学号：1241410026
年级：2010级学院：生命科学学院
膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出
对话诺奖大师（更新版，有些人上传的答案有误） 1.11 【单选题】一些研究者认为，现代人类语言是何时产生的？（A） A 、旧石器时代初期B、旧石器时代晚期C、新石器时代初期 D 、新石器时代晚期 2 【多选题】下列不属于印欧语系的有（ABC ）。 A 、匈牙利语 B 、芬兰语C、爱沙尼亚语 D 、英语 3【判断题】远古人类语言的研究在美国不太受欢迎。 （对） 4 【判断题】语言和 DNA 之间没有严格联系。 （对）●远古人类语言的研究使用了（比较语言学）的研究方法。 1.21 【单选题】研究两种语言是否有联系及联系紧密程度的方法是（ C）。 A 、语言相较法 B 、语言核心法C、词汇统计学法 D 、词汇重构法 2 【多选题】盖尔曼认为追溯语言发展史可以使用的方法有（CD ）。 A 、研究类人猿发音 B 、结合人类DNA C 、使用文献自己的语言 D 、重建始祖语言 3 【判断题】任何代表某种历史现象的语族都有一种原始语言。 （对） 1.31 【单选题】下列属于亚非超语系的是（ A ）。
A 、闪族语 B 、乌拉尔语系 C 、印欧语系 D 、汉藏语系 2 【多选题】下 列属于欧亚超语系的是（ABCD ）。 A 、乌拉尔语系 B 、印欧语系C、阿尔泰语系 D 、闪族语 3 【判断题】 波伦语是包含四大超语系的超超语系。 （对） 4 【判断题】日耳曼语是印欧语系的一个分支。 （对） 1.41 【单选题】原始闪语中表示山丘的单词为（ B ）。 A 、tul B 、tall C 、tulv D 、twn 2 【单选题】 pidi 是表示（ C） 的单词。 A 、河流 B 、山谷C、山丘 D 、海洋 3 【判断题】印欧语表示数字二的 单词为duwo 。 （对） 2.11 【单选题】马普学会最重要的研究部分是（C）。 A 、应用数学 B 、材料科学 C、基础科学研究 D 、应用技术研究 2 【单选题】克劳斯·冯·克利钦 是德国马普学会（ B ）所长 A 、智能系统研究所 B 、固体物理研究所C、生物物理研究所 D 、引力物理研究所 3 【单选题】克劳斯·冯·克利钦因发现 （ D ）获得了诺贝尔物理学奖。 A 、相对论 B 、 X 射线 C、物质的拓扑相变和拓扑相 D 、量子霍尔效应 4【判断题】马普学会的研究所仅仅在德国才有。 （错） 5 【判断题】克劳斯·冯·克利钦是单独获得了诺贝尔物理学奖。
膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。
第二章脂类、生物膜、跨膜运输和信号转导
20.（"）血浆脂蛋白中，低密度脂蛋白负责把胆固醇运送到肝外组织。（04年）
31.为什么说低密度脂蛋白（LDL）中的胆固醇是“bad cholesterol"，而高密度脂蛋白（HDD 中的胆固醇是“good cholesterol" ? （07 年）
Microvilli Epithelial cell Glucose Bloo d Basal surface \ Apical surface Intestinal lumen - ?? 2IC 如?? C ATPase Glucose O —M 二.-. Glucose uniporter Na'gluE ^^ElUT2 symporter 到静息状态。 35. 根据下图说明葡萄糖在小肠被吸收进入血液循环的机制。（12年） 答：小肠肠壁细胞有两个面，其中一面作为肠内毛细血管的外壁，上有Na/K 泵及葡萄糖自由扩散 通道，而另一面面向小肠空间，上面有大量绒毛状的突起，在突起处有Na/葡萄糖协同转运载体。 首先，小肠肠壁细胞通过Na/K 泵，每运转一次将3个Na 离子泵出细胞，两个K 离子泵入细胞，建立起 细胞外正内负的膜电位，使得细胞内带负电荷，细胞外带正电荷且具有很高的Na 离子浓度。而处于 小肠空间…面上的Na/葡萄糖协同转运载体，结合小肠中的2个Na 离了及1个葡萄糖分子利用小肠 中与小肠肠壁细胞内的Na 离子浓度差，将Na 离子及葡萄糖分子转运进入小肠肠壁细胞，进入细胞中 的2离子很快又被血管壁面的Na/K 泵泵至血液中，而进入的葡萄糖亦很快由葡萄糖扩散通道进入血 液，细胞内回复到初始状态，开始下一轮循环。在这种机制下，葡萄糖由小肠进入血液循环。 36. 简述第二信使的主要类别及其作用机制。（12年） 答：细胞内有5种最重要的第二信使：cAMP 、cGMP 、DAG 、IP3及Ca2+。cAMP 由腺昔酸环化酶水解 细胞质中的ATP 产生，cAMP 通过蛋白激酶A 进行信号放大，蛋白激酶A 将ATP 上的磷酸基团转移到特定 蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上进行磷酸化，调节靶蛋白的活性。鸟甘酸环化酶受体，受体本身就 是鸟昔酸环化酶，催化GTP 生成cGMP, cGMP 激活PKG,被激活的蛋白激酶G 可使特定蛋白质的幺幺.氨酸 或苏氨酸残基磷酸化，从而引起细胞反应。磷脂酶CB 水解质膜上的PIP2,产生IP3和DAG, IP3同质 膜上特异的IP3受体结合，使Ca 离了从内质网中释放出来，?方面协同DAG 激活蛋白激酶C,另?方 面与钙调蛋白结合引起其他反应。
生理学教学大纲 （供五年制临床专业使用） （依据全国统编教材第七版修订） 生理学教研室修订 第一章绪论 【教学目标与要求】 掌握：内环境与稳态、反馈调节等基本概念。 熟悉：机体功能活动的调节方式。 了解：人体生理学的研究内容、研究方法，人体生理学与医学的关系。 【教学内容】 掌握： 1. 内环境与稳态；反馈调节（负反馈、正反馈、前馈）以及生理功能的自控原理。 熟悉： 1. 人体机能活动的调节：神经调节（非条件反射、条件反射），体液调节（激素、 局部体液因素），自身调节。 了解： 1. 人体生理学的研究内容、研究方法，人体生理学与医学的关系。 【教学方法】多媒体教学，课堂讲授，画图 【思考题】 1. 何谓内环境及其稳态？为何必须维持内环境相对稳定？机体将如何维持内环境相对稳定？(提示：如何维持内环境相对 稳定这一问题有待学完全书后解答) 2. 人体生理功能的调节主要有哪几种方式？它们是如何调节的？ 3. 何谓正反馈和负反馈？试各举一例说明它们在生理功能调节中的作用及意义。 【授课时数】讲授2学时 第二章细胞的基本功能 【教学目标与要求】 掌握：细胞膜的物质转运功能，细胞的生物电现象，兴奋的产生和传导机制，神经-肌肉接头兴奋传递过程。 熟悉：肌肉收缩的外部表现、骨骼肌原理及肌肉收缩力学分析。 了解：细胞膜的基本结构。 【教学内容】 掌握： 1. 细胞膜的物质转运形式（单纯扩散、载体和通道中介的易化扩散、主动转运、 继发性主动转运、出胞和入胞）。 2. 静息电位：静息电位、极化，超极化的概念，静息电位的产生机制（静息电位 和K+平衡电位）及其研究手段。
3. 动作电位：动作电位、去极化、复极化、反极化、超射的概念；刺激引起兴奋 的条件：阈值、兴奋性和兴奋，阈电位与局部兴奋；组织兴奋及其恢复过程中兴奋性的变化（绝对不应期、相对不应期、超常期、低常期）；动作电位的产生机制（锋电位与Na+平衡电位）及其研究手段（平衡电位、改变离子浓度；通道阻断剂；电压钳与膜片钳）；兴奋的传播：兴奋在同一细胞上的传导，局部电流，跳跃式传导；动作电位的特点及其意义。 4. 局部电位：局部电位的概念、分类（去极化与超极化）、特点与产生机制。 5. 神经-肌接头的兴奋传递过程（终板电位的概念及产生机制）、特征。 （细胞的信号转导将在内分泌章讨论）。 熟悉： 1. 肌肉收缩的肌丝滑行理论；兴奋-收缩耦联、张力-速度关系曲线，长度-张力 关系曲线，最适初长度。 2. 肌肉收缩的外部表现和力学分析：单收缩、强直收缩；前负荷、后负荷；等长 收缩、等张收缩；V max，P0；肌肉的收缩能力。 3. 钙离子在耦联中的作用。 了解： 1. 了解单位膜的分子组成，液态镶嵌模型。 2. 骨骼肌的细微结构，肌小节，粗肌丝和细肌丝，肌管系统。 【教学方法】多媒体教学，课堂讲授，画图 【思考题】 1. 常见的跨膜物质转运形式有哪几种？各自的转运机制如何？ 2. 何谓跨膜信号转导？细胞主要通过哪些方式进行跨膜信号转导？各自机制如何？ 3. 何谓兴奋性？它与兴奋有何区别？组织兴奋及其恢复过程中兴奋性有何变化？ 4. 神经纤维上的静息电位有何特点？它是怎样产生的？有何实验依据？ 5. 何谓动作电位？试述神经纤维上动作电位的波形、特点和形成机制。 6. 试区别阈电位与阈强度的概念，以及各自对产生动作电位的作用。 7. 何谓局部兴奋？它有哪些特点？并指出在哪些方面与动作电位不同？ 8. 兴奋如何引起？又如何在同一神经纤维上传导？ 9. 神经-肌接头处的兴奋传递是如何进行的？如何加以证明？ 10. 骨骼肌的收缩机制目前都用“肌丝滑行学说”加以解释，其依据是什么？ 11. 何谓兴奋-收缩耦联？它包括哪些过程？其结构基础和耦联因子是什么？ 12. 试区别骨骼肌的等长收缩和等张收缩，以及单收缩和单收缩的复合的概念。 13. 骨骼肌收缩受哪些因素的影响？如何影响？ 【授课时数】讲授12学时 第三章血液 【教学目标与要求】 掌握：红细胞生成的调节，血液在内环境中的地位和作用、生理性止血与凝血的过程与机制；血量、输血与血型鉴定的生物学意义。
膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位
的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。
膜片钳常见问题解答（一） 1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？ 答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生 的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流 的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。膜片钳技术钳 制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使 尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使 单通道微弱的电流得以分辨出来。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一 数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。 随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用 电压钳技术，还常采用电流钳技术。 2.离子通道电导的单位是什么？如何换算？ 答：离子通道电导的单位是西门子（ Siemens, S），旧称姆欧，即安培 /伏特。常用皮西门子（ pS），1pS＝10E-12 S， 1,000 pS＝1 pA/mV。 3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的 ANALOG IN接口? scaled output，raw output有什么区别? 答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、 放大等）， scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。后者的灵活度大，因此多采用。目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的 ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用 Raw output了。若你想记录两个输出， 则需要将 Raw output与数模转换器的另一个 ANALOG IN连接。 4.在 Clampex 的 Edit protocol/Wave 中，Step和 ramp各有什么适用范围？ 答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去 极化的情况下，通道很快失活，无法使用 ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用 ramp。 5.什么是 ramp？有什么作用？
膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导
【讨论】LTP的机制的讨论（仅限于纸上谈兵的理论交流） 附几张图 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=393 title="Click to view full 4.JPG (718 X 441)" border=0 align=absmiddle> 附几张图 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=393 title="Click to view full 5.JPG (718 X 441)" border=0 align=absmiddle> xnbluesky wrote: 1、谢谢bluebacopa 2、的确是脑片上做的，感觉不对劲 3、附几张图，麻烦分析下! 从你画的这张图上看，记录电极不在CA1，而好像在CA2了，CA1应该在右方的下部，自己对照标准图谱再看看。当然，电位是肯定诱发出来了。 cma1954 wrote: 从你画的这张图上看，记录电极不在CA1，而好像在CA2了，CA1应该在右方的下部，自己对照标准图谱再看看。当然，电位是肯定诱发出来了。 谢谢！我是真的搞晕了，能不能给我发张图看看！ xnbluesky wrote: 谢谢！我是真的搞晕了，能不能给我发张图看看！ 你去查一查大鼠的脑定位图谱吧，会对你有帮助。 谢谢cma1954 。 谢谢cma1954 。 受益匪浅啊
计划从1-2周后开始更新 希望继续和大家交流 由于长时间疏于更新，还不能确定从哪里开始，想先谈一谈纹状体的突触可塑性，或者大家有什么好的建议？ GOOD NEWS! 能否谈一谈mGluRs相关的对LTP和LTP的影响？特别是mGluR1.5对LTD的相关的？呵呵这一方面很欠缺，本来是学临床的，现在老板正想让我做这一方面的，一切都从零开始。 快乐的鸽子您写得很赞哦 非常喜欢你写的文章，感觉就像看一段段美文 哈哈 好，那就写一些关于mGluRs的，不过因为工作太忙了，只有周末才会过来更新，期望值不要太高了。 “mGluR1.5对LTD的相关的“可能太具体了，不知道能写多深，但是如果有什么问题我可以看看能不能帮忙 期待中！ 我也作过一些有关LTP的工作, 很高兴bluebacopa战友能总结一些LTP的机制,看到了你的提纲,觉得不错,但我认为从诱导(induction) 和维持(maintain)两方面探讨似更好些. 为什么我做大鼠脑片的EPSP时，做不出来突触前排放。见下图。谢谢解答！ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=214 height=196 title="Click to view full 图片1.jpg (214 X 196)" border=0 align=absmiddle> 请教一下，用HFS诱发LTP的时候，强度是怎么样选择的！ 我的纪录的技术可能不是很好，用的仪器几年都很稳定没有遇到过什么问题，所以解决实际问题的能力差些，所以只能在理论交流方面做的多一些。 不过我觉得欧姆的presynaptic component 还是有的，不过是被过大的刺激伪迹掩盖了，可能和所用的电极有关。 HFS诱发LTP, 一般的情况下用诱发最大幅度EPSP所需刺激强度的1/3，但根据实验目的不同也有变化。
膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，
细胞是动植物和人体的基本组成单元，离子通道是细胞与外界以及与细胞内通信的重要手段。离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础。生物电信号通常用电学方法进行测量，因而形成了一门学科—细胞电生理学。最近50年，三次主要的技术革命推动了细胞电生理学的进展：细胞内记录，电压钳技术和膜片钳技术。 膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）激活的单通道离子电流，从而产生 O 了膜片钳（Patch Clamp）技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cm H 2的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声水平，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs 的时间分辨率。1983年10月，《Single-Channel Recording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑，为细胞生理的研究带来了一场革命性的变化，膜片钳技术象基因克隆技术一样，给生命科学研究带来了巨大的动力。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 1995年，《Single-Channel Recording》一书再版，增添了大量膜片钳技术的新内容，几乎当时国际上所有的知名膜片钳专家都参与了编写，成为目前膜片钳技术研究领域的最经典著作。 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，该电流强度就代表单一离子通道电流。 膜片钳记录技术自创立以来，经历了许多发展变化： （1）记录方式有很大变化。除了传统的单通道记录方式以及普通全细胞记录方式外，又陆续发展了膜穿孔记录方式（Perforated patch clamp）、巨膜片记录方式（Giant membrane patch）、松散封接记录方式（Loose patch clamp）等等。 （2）应用技术不断涌现。例如，为了更换电极内液和从电极内施加药物，发展了微电极内灌注技术（Micropipette perfusion technique）；在研究细胞间的缝隙连接（Gap junction）通道时，发展了双膜片记录法（Double patch recording）；将富含神经递质受体的游离膜片靠近突触部位，可检测递质释放和突触活动，这一技术称为膜片探针技术（Detector-patch technique）；若将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检测细胞内第二信使含量，此为膜片填塞技术（Patch cramming technique）；为研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜电容测定法（Membrane capacitance measurement）。此外还有很多膜片钳应用技术，而且一些新的技术正不断涌现，膜片钳技术可以说是日新月异。
对话诺奖大师（更新版，有些人上传的答案 有误） 1.1 1【单选题】一些研究者认为，现代人类语言是何时产生的？（A） A、旧石器时代初期 B、旧石器时代晚期 C、新石器时代初期 D、新石器时代晚期 2 【多选题】下列不属于印欧语系的有（ABC）。 A、匈牙利语 B、芬兰语 C、爱沙尼亚语 D、英语 3【判断题】远古人类语言的研究在美国不太受欢迎。（对） 4【判断题】语言和DNA之间没有严格联系。（对） ●远古人类语言的研究使用了（比较语言学）的研究方法。 1.2 1 【单选题】研究两种语言是否有联系及联系紧密程度的方法是（C）。 A、语言相较法 B、语言核心法 C、词汇统计学法 D、词汇重构法 2 【多选题】盖尔曼认为追溯语言发展史可以使用的方法有（CD）。 A、研究类人猿发音 B、结合人类DNA C、使用文献自己的语言 D、重建始祖语言 3 【判断题】任何代表某种历史现象的语族都有一种原始语言。（对）
1.3 1 【单选题】下列属于亚非超语系的是（A）。 A、闪族语 B、乌拉尔语系 C、印欧语系 D、汉藏语系 2 【多选题】下列属于欧亚超语系的是（ABCD）。 A、乌拉尔语系 B、印欧语系 C、阿尔泰语系 D、闪族语 3 【判断题】波伦语是包含四大超语系的超超语系。（对）4 【判断题】日耳曼语是印欧语系的一个分支。（对）1.4 1 【单选题】原始闪语中表示山丘的单词为（B）。 A、tul B、tall C、tulv D、twn 2 【单选题】pidi是表示（C）的单词。 A、河流 B、山谷 C、山丘 D、海洋 3 【判断题】印欧语表示数字二的单词为duwo。（对）2.1 1 【单选题】马普学会最重要的研究部分是（C）。 A、应用数学 B、材料科学
2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流
电生理实验常见问题解答（1）『』 2010-10-09 14:53 请问目前分析细胞外放电的信号处理软件较好的是什么？ 价格昂贵的有国外的PCLAMP系列软件和POWERLAB；价格便宜的较好用的有国产的PCLAB 和MEDLAB。如果感兴趣输入GOOGLE，一搜即知。axon guide是很经典的哦，大家可以到公司主页上下载本书主要针对PATCH，是AXON公司的产品配套广告说明书，但是也包含了不少基本电生理知识，集中阅读一下第1、2章节有帮助。可以下载看看，如下，.axon.请教：干扰的大小如何检测？ 检测干扰大小和你记录电信号一样，可以从相关软件读出来，也可以从示波器上读出。建议丁香妹妹找一些基础电生理书籍熟悉一下，不要着急，先入门为重。 请问微电极的电阻如何测量?怎样才能保证电极尖端已被电极液完全充满? 给予电极一个电流/电压，可以从示波器上读出来，也可以从相应的放大器上显示出来。建议购买带有芯的玻璃电极，这样可以简单地从尾部灌入液后，轻轻用手指敲打电极即可；如果是无芯电极，就需要先用注射器将电极尖端充满，而后在从尾部灌入液。 问题是有时尖端太细,从尾部注入液后,很难保证尖端全被充满. 注射器接皮管——皮管接电极尾部——电极尖端深入电极液中——抽吸注射器——电极尖端充满液体——再从电极尾部管电极液——解决问题了。 我在记录细胞外放电时,干扰太大,诸如50hz的交流电干扰,请问如何尽可能地排除这些干扰信号? 交流电干扰应该不难处理，只需要中间接一个直流电转换器即可。 我想用Patch做平滑肌的BK通道,请教Pleace前辈,在酶解法分离细胞时,使用DMEM会因为含钙高而影响结果吗?文献多数都用无钙液，如果使用前我用PBS洗三次是否可以？ 你最好用无钙液，即使后来用PBS洗三次也不可以。因为之前的无钙液操作不仅可以保护细胞，而且可以使之处于低兴奋状态。 屏蔽和接地是电生理基本要求。如果你记录的信号足够大的话，可以不用屏蔽。但生物电信号一般都很弱，这就是为什么要屏蔽和接地。也是为什么很多时候晚上做实验干涉小——因为晚上用大功率电器的人相对少些，空间的电磁干扰相对小些，地线相对也干净一些。屏蔽笼即法拉第笼，一般是一层铜网，一层铁网。铜网屏蔽电，铁网屏蔽磁。屏蔽笼和系统的信号共地。关于地线，根据你的系统所记录的信号的强弱要求可以不同，信号越弱，要求越高。一般细胞外记录甚至更粗的记录要求相对不高。要是做到单通道水平，就不是凑合能解决问题的。就是这样，电生理的地线也应该和公共地线区分开来。一般比较正规的电生理实验室的地线应该单独埋设。地线埋设的要求其实很简单，尽量减小对地电阻。但实施起来就有很多方法了。我听说的一个方法是：从实验室下到地的主线用大概10cm 的铜缆。地上要挖个深1.5—1.8m、1.5*1.5m宽的坑。铜缆用铜铆钉（尽量减少材质造成的电阻差异）焊在一块1.5m*1.5m*4cm的铜板上。铜板放入坑中。板上埋2.5kg食盐、2.5kg 木炭。再将坑添上。主线到各个信号地分支点用铜棒焊接。铜棒上钻孔接地线。仪器电源不直接接到公共电源上，而是通过稳压隔离电源后接到另设的电源上。仪器电源的地线和系统的信号地分开接地。信号地接到单独埋设的地线上。仪器电源的地线也就是三相插头的顶端那个插头很多时候不接。 震动太大：可能原因有防震台防震效果不好，充气不足，或是实验室附近有什么强振动源；记录槽设计是否合理；液体流速是否太快？ 记录系统是否稳定：微电极放大器电容补偿是否调好，是否需要校正？记录系统干扰和噪声情况如何？