动物细胞工程基础实验

28
思考题
1. 配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物 质，为什么？如何调节培养液的pH？
2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添 加，为什么？
3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法 有哪些，如何使用？培养基过滤后需要加 哪些物质？为什么？
29
实验二 细胞传代培养
【实验原理】
1. 贴壁生长和悬浮生长。 2. 贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培
2. 在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无 菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精 灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃ 冰箱保存备用。标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、 以及组号与组长姓名。
25
配制液体培养基
1. 将培养基干粉（PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加 800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈 橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量 瓶，用三蒸水定容至刻度。
EPC细胞（消化前）
EPC细胞（消化中）
EPC细胞（传代后） 37
思考题
1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事 项。
2. 常用的细胞消化液有哪些？ 各种消 化液的作用原理分别是什么？
3. 悬浮生长的细胞如何传代培养？
38
17
考核方法
1. 平时成绩占20％（考勤和课堂表现） 2. 实验报告占60％（包括实验目的、原理、
步骤、结果（有图片及说明）、讨论以及 思考题。报告格式规范、详略得当） 3. 卷面考试占20％（名词解释、简答题、 分析题）
18
修读要求
1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察
34
5. 胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，从培养瓶 侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒置显微 镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻 转培养瓶，使细胞脱离胰酶；
6. 中和消化：用移液管吸取2 mL新鲜生长培养基，加 入细胞培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打 消化好的细胞使其脱里瓶壁并分散；
9. 接种细胞：吸取4 mL上述的细胞悬液，加入原细胞 培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各4 mL；
10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、 代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置来自百度文库 养；
11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进 行第2代的传代。
36
EPC细胞（消化前）
2. PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高 压灭菌备用；
3. 将PBS分装入试剂瓶中，瓶盖转松，牛皮纸包紧，橡皮 筋加固，装入提篮，121℃，20min灭菌；
4. 自然干燥冷却后，4℃保存备用。
23
配制胰蛋白酶（0.25%）
1. 称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制 的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。
常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 血清：小牛/胎牛血清。 动物细胞离体培养常常需要血清。血 清提供生长必需因子，如激素、微量 元素、矿物质和脂肪。
14
鱼类细胞培养的基本条件
5. 支持物 大多数动物细胞贴壁生长。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶 等作为支持物。
6. 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为 5%。
2. 将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无 菌试剂瓶（100 mL），每瓶90 mL，余下装入500 mL 无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青 霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1%。
26
配制液体培养基
3. 试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签， 封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明： PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。
4. 用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长 培养基内血清浓度为10%。
27
超净工作台的使用
1. 工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟；
2. 关闭紫外灯，打开吹风和照明灯； 3. 带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手； 4. 超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦
净。 5. 在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。
2. 关闭紫外灯，打开吹风和照明灯； 3. 带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手； 4. 超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦
净。 5. 在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。
32
操作步骤
1. 观察细胞： 倒置显微镜 下观察细胞。 当细胞长满 瓶底时可以 传代。
EPC细胞
33
2. 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具 用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台 酒精灯左侧；
2. 材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL），无菌离心 管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒 精，酒精喷壶，抽纸，记号笔，橡胶手套，封口 膜
3. 仪器：生化培养箱，倒置生物显微镜，超净工作 台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱
31
超净工作台的使用
1. 工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟；
动物细胞工程基础实验
动物细胞工程
动物细胞工程，是应用细胞生物 学和分子生物学的理论和方法，按照 人们的设计，进行在细胞水平上的遗 传操作,从而获得新型生物。
6
动物细胞工程常用技术
¾ 动物细胞培养技术 ¾ 动物细胞融合技术 ¾ 单克隆抗体技术 ¾ 胚胎移植技术 ¾ 细胞核移植技术
7
动物细胞培养
细胞培养是指从动物活体中取出小 块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理 环境条件下，进行培养，使之继续生存、 生长、增殖。 9 原代培养 9 传代培养 9 细胞系
12
鱼类细胞培养的基本条件
3. 渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需 用平衡盐溶液配制各种试剂。
常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution）
D--Hanks
13
鱼类细胞培养的基本条件
4. 营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖 和生长所需要的各种物质。
3. 仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱
21
实验准备
¾ 器皿：洗液浸泡冲洗/洗涤液刷洗--自来水 冲洗--三蒸水涮洗--烘干--包装高压灭菌
¾ 灭菌：干热、高压、紫外线、过滤 ¾ 洗液：浓硫酸+重铬酸钾 ¾ 包装：牛皮纸、饭盒、移液管盒、试剂瓶
22
配制PBS（1000mL）
1. 分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ； KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分 溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度， pH7.2-7.4；
7. 去离子水/三次蒸馏水
15
鱼类细胞培养的基本条件
8. 无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所
需的细胞进行培养，但环
境中（如空气）有各种其
他微生物，必须对所需细
胞进行无杂菌的隔离培养。
无菌条件是细胞离体培养
最基本的条件。
超净工作台
16
实验室仪器设备
实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： • 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 • 干燥箱: 用于干燥 • 超净工作台: 用于无菌操作 • 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 • 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 • 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 • 液氮罐：用于细胞长期保存
和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和助教
协商，各组时间要相对集中和固定。
19
实验一 试剂配制与实验准备
【实验原理】
1. 磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS） 用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。
2. 培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通 常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常 用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和 RPMI-1640。
养瓶底部长满，需要将细胞消化下来，并接种成 多瓶细胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过 程就叫传代。 3. 细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供 实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之 一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
30
【试剂、材料与仪器】
1. 试剂：生长培养基（PRMI-1640，添加10% 胎牛 血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA
2. 拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶 （100 mL），每瓶50 mL。
3. 试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签， 封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明： 0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长 姓名。
24
配制EDTA（ 0.2%）
1. 称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻 棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容 量瓶里，终浓度为0.2%，pH调为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。
3. 开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严 禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内液体（旧培 养基）倾去，培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管管口、 管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；
4. 清洗细胞表面：取一次性无菌移液管，安装好加 液枪，酌情吸取 2-4 mL EDTA溶液，清洗细胞表 面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再 倒弃EDTA溶液；
2. 材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量 纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试 纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次 性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机， 医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶 （500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸， 橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜
3. 胰蛋白酶（Trypsin）可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消 化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
4. EDTA溶液 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离 子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
20
【试剂、材料与仪器】
1. 试剂：NaCl；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA； 胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS
7. 沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL的离心管中， 1000 rpm/min 离心8分钟，获得细胞沉淀；
35
8. 加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注 意只能倒一次，不能反复倒），然后用另一新移液 管吸取4 mL的新鲜培养基加入新培养瓶中，吸取4 mL加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细 胞悬液加入细胞培养瓶中混匀；
10
鱼类细胞培养的基本条件
1. 温度
温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。 温度过高导致细胞死亡。 适宜的温度：25-28℃（温水性鱼类)、
15-20℃(冷水性鱼类)、37℃(水生哺乳 动物)。
11
鱼类细胞培养的基本条件
2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋 白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 HEPES 调节培养液的pH 至7.4左右。
8
细胞培养在水产业的应用
9 鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒 疫苗的制备
9 鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等 9 水产基础理论 9 鱼类免疫学 9 鱼类遗传学
9
本实验课的目的
¾ 培养实验的思维，提高实验技能， 锻炼动手能力。
¾ 掌握无菌操作，养成规范的实验室 工作习惯。
¾ 为将来适应多种领域的工作打基础。