蛋白质相互作用

蛋白质相互作用研究方法
蛋白质之间相互作用研究的重要性
• 后基因组时代(post-genomic era) • 在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成
大的复合体，在特定的时间和空间内完成 特定的功能，而且有些蛋白质的功能只有 在复合体形成后才能发挥出来，如依赖于 构象变化或翻译后修饰的蛋白质功能
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而 形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主 要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括 DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、 信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间 的相互作用。
Binding Domain
Reporter Gene
Principle of yeast two-hybrid system
未知蛋白
研究對象
Major steps
Construct target plasmid and bait plasmid Transformation Screening DNA extraction DNA sequencing
测的相互作用仅有3% 在两种以上的实验中得 到验证。
Myriad’s ProNet Two-Hybrid Process
• Industrial-scale application of the yeast two-hybrid system
• Roboticized bait creation process • Custom activation domain libraries • Efficient mating strategy • Automated for quality and throughput
5. 免疫沉淀反应后，在4°c 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼 脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓 冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 分钟；
6. SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
实验注意事项
（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存 在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂 （np40或triton x-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通 过经验确定。不能用高浓度的变性剂（ SDS)，细胞裂解液 中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
Co-IP工作示意图
Co-immunoprecipitation
Y Y
binding
wash
elution
利用western blot 确定捕获蛋白
通过质谱确定捕获的蛋白
实验步骤
1. 收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）， 冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°c， 最大转速离心30 min后 取上清；
• 可检测瞬时、不稳定的两两相互作用， • 整个过程只需要基因操作，方法简便，灵
敏，高效，很容易实现蛋白质相互作用的 高通量自动化分析。
缺点
• (1)不能研究具有自激活特性的蛋白质； • (2)只能检测两个蛋白间的相互作用； • (3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不
能定位到细胞核中的蛋白质无法研究； • (4)大部分实验中有将近50%的假阳性率，且推
2. 取少量裂解液以备western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的 抗体加入到细胞裂解液，4°c缓慢摇晃孵育过夜；
3. 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次 3,000 rpm离心3 min；
4. 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜 的细胞裂解液中, 4°c缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A 琼脂糖珠偶连；
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 (3) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而
并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的 发生；
(4) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中 添加抗体后不会引起共沉淀；
Column CoIP
Column CoIP
http://www.piercenet.com
GST pull-down
蛋白相互作用
http://www.piercenet.com/media/ez-detect_pulldown_assay.gif
GST Pull-down
方 法：
1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组 蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未 知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应（ 4ºC 2h） 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋 白中是否有目的蛋白
– Positive sample tracking – Robots for media preparation, liquid
handling, colony picking – Statistical quality control
ProNet Process Flowchart
1
0
1
4
2
3
3. 如用western blot检验，必须在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，若预测不正确，实验就得不到结果。
Summary
3.酵母双杂交系统
目录
The Two-Hybrid System
• Two hybrid proteins are generated with transcriptBiblioteka Baiduon factor domains
该方法只是用于确定体外相互作用。
两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
GST-谷胱甘肽相互作用
GST pull-down 蛋白纯化
GST fusion protein Glutathione column
Glutathione bead
NdkB
6755399
Sam68
6671538
4串联亲和纯化（TAP)
• 该方法选用了两个连续的标签进行相互作 用蛋白的纯化。
• 标签分三部分：蛋白A，C B P(calmodulin binding peptide，钙调素结合多肽)和中间 连接的TEV 酶识别的酶切位点。
A:标签中的ProteinA 与固化的IgG 结合，缓冲液淋洗去除不能结合的杂蛋白， TEV 酶切分离ProteinA 和靶蛋白； B:利用CBP(Calmodulin binding peptide)-Calmodulin 的相互作用进一步纯化 复合物，缓冲液洗去杂蛋白。加入过量的螯合剂(EGTA) 螯合Ca2+，使纯化的复合物与层析柱分离。
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Interactions
34
33
31
32
50
35
36
Seq
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57
38
39
54
55
Seq
58
59
60
61
62
64
4
63
Seq
cdc42
WISH
Actin Cytoskeleton
SOS2
CamK II
Dbl CAP
PI3Kg (p110) PDK1
Btk NdkB
CD19 CD22 Fyn
1 GST融合蛋白进行Pull-down
（1）原理 细菌表达的谷胱甘肽s-转移酶（GST）融合蛋白主要用于 蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与 溶液中的特异性蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球 珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。 一般在得到目标蛋白的抗体前，可以采用GST融合蛋白 Pull-down 。
AIP
4633514
8567325
cdc42
WISH
Actin Cytoskeleton
26326968
Cbl-b
20894430
SOS2
CamK II
13542677
CD19 CD22
Dbl CAP
PI3Kg (p110) PDK1
3064262
Protein 4.1G
Btk
19070197
Fyn
优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态；
2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响；
3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复 合物。
缺点
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用
2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而 可能有第三者在中间起桥梁作用；
Yeast two-hybrid system
酵母双杂交系统的应用
（一）分析已知蛋白之间的相互作用 （二）分析未知蛋白相互作用 （三）绘制蛋白质相互作用系统图谱
优点
• 在酵母细胞内用作诱饵蛋白的真核生物蛋 白更有可能正确折叠和进行翻译后修饰，
• 研究方法接近于体内环境，无需蛋白分离 纯化等步骤，
• Since the reporter gene typically codes for a survival factor, yeast colonies will grow only when an interaction occurs.
Activation Domain
Prey Protein Bait Protein
• Giot L, et al. A protein interaction map of Drosophila melanogaster. Science, 2003, 302(5651):1727~1736
• Li S M, et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science, 2004, 303(5657): 540~543
Bait Protein
Activation Domain
Prey Protein
Binding Domain
Reporter Gene
• Interaction of bait and prey proteins localizes the activation domain to the reporter gene, thus activating transcription.
该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行
2 免疫共沉淀
•免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原 之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的 经典方法。 •是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效 方法。（在体） •其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞 内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下 来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结 合的蛋白质y也能沉淀下来。 •这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合； 也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。
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1 Bait Construction
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2 Bait Verification
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3 Two-Hybrid
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Screen
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4 Identification and
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Confirmation of
• Stelzl U, et al. Cell, 2005, 122(6): 957~968
• Gavin A C, et al. Nature, 2002, 415(6868): 141~147
• Rain J C, et al. The protein-protein interaction map of Helicobacter pylori. Nature, 2001, 409(6817): 211~215
内容
• 蛋白质与蛋白质之间相互作用 • 蛋白质与核酸之间相互作用 • 蛋白质与药物分子之间相互作用
常用蛋白质相互作用的研究技术
各种亲和分析（Pull-down，Co-IP，生物素-亲和素系统等） 酵母双杂交/酵母三杂交 串联亲和纯化（TAP) 噬菌体展示文库筛选 化学蛋白组学方法 蛋白质芯片 相互作用数据库
• Both fusions are expressed in a yeast cell that carries a reporter gene whose expression is under the control of binding sites for the DNAbinding domain