石蜡切片法

石蜡切片的主要过程
取材——固定保存——冲洗——脱水—— ——透明——石蜡透入——包埋——修 块——切片——贴片——复水——染色— —脱水——封藏——观察保存
（一）包埋



（二）修块、切片、贴片
（三）染色、封藏
一、实验材料及用品
实验材料：植物叶片、小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片；温箱、包埋盒、水盆 等、切片机、毛笔等。 实验药品：石蜡、蛋白黏贴剂。
苦味酸液（波茵氏液）
甲液： 1％铬酸 10％醋酸 乙液： 甲醛 苦味酸饱和水溶液 50ml 20ml 25ml 75ml
是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊 椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的 雌配子体和被子植物的胚囊的固定。
此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良 好。一般动物组织固定12—24h，小块组织数小时即可。固定后直接 入70％酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料 的固定时间为12—48h。
切片过程中出现问题的一般原因和补救办法 ：
一、蜡带弯曲不直 原因：1.蜡块上下两边不平行，或与刀口不平行；2.刀口锋利不一，局 部产生差异；3. 材料未居蜡块正中央。

补救办法： 1.取下台木，将蜡块两边修平，调节夹物部，使两者平行。 2.移动刀片，改用新刀口。3. 用刀片切去部分石蜡，使材料居中。
二、实验步骤（4）
修块：削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平 面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方 形，每边的长度为0.2mm～0.3mm ；
修块的目的： 1）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲； 2）每个切片组织的距离接近，便于镜检或作连续切片。

要求：组织块必须 ①上下平行，② 但左右的蜡、上下的蜡不要
浸蜡： 要点：使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地贴在细胞 壁的内外，成为不可分离的状态； 原则：低温 高温、低浓度 高浓度
二、实验步骤（3）
包埋：就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸 盒中，使之凝固。
包埋前折纸盒 包埋时将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯， 倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速且轻轻地用温镊子夹 取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材 料，使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢平放于水盆 的水面上，待蜡盒内的石蜡表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水 从一边浸入纸盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋块迅速凝固，待石 蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

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三、实验结果
包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有 气泡。
包埋材料摆放的位置是否符合要求？
修块效果：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇 平行。
切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。 展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢 固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。
脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜， 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤（2）
透明（置换） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。
原因：1.室温过低。2.石蜡过硬。3.材料边缘留蜡太少。4. 刀的角度不 合适。 补救办法： 1.在切片机上安一盏电灯加温。2.用手指在蜡块面上磨擦。 3.重新包埋。4.矫正刀的角度。 原因：1.室温过高。2.石蜡过软。3.刀口上留有一层石蜡。4.刀口钝。 补救办法： 1.在早晚凉爽时切。2.将蜡块投入凉水中稍浸。3.用二甲苯 拭去石蜡。4.磨刀或移动刀口。
二、切片分离，不能连成带状或卷起成圆筒状。
三、切片粘附于刀片上，皱褶在一起。
切片过程中出现问题的一般原因和补救办法 ： 四、切片纵裂横波。厚薄不均匀。
原因：1.刀口有缺口；2.石蜡块中有颗粒及杂质；3.刀口有细纤 丝或碎屑；4.刀和台木未夹紧；5.组织块太硬。 补救办 法： 1.可移动刀片；2.将颗粒挑去；3.清洁刀口；4.旋 紧螺旋；5.在水中浸泡。
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
石蜡切片法
—— 包埋、切片和贴片
石蜡切片法
石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了
藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既 可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也
可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，
它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握， 同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。
二、实验步骤（6）
切片的步骤：
将已经修整好的蜡块装在样品固定器上，并固定好； 将切片刀安装在切片机的刀架上，调节切片刀的角度为15°左右，并固 定好； 调节切片的厚度：棉花叶片：8-10um；小鼠肝脏：6-9um； 调节蜡块与刀口的距离：打开刀架固定钮，推动刀架，使切片刀刃贴近 蜡块表面（从侧面观察），再固定刀架； 切片：打开停刀轧，开始切片，右手握住手轮柄，顺时针方向摇动，每 摇动一圈就切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时就连在 一起，连续摇转手轮就可以讲切下的蜡片练成一条蜡带。待蜡带有一定 长度，左手执毛笔，将蜡带抬起，边摇边移动蜡带。待蜡带长至2030cm，停止摇动，用右手执另一支毛笔顺刀口方向拔下蜡带，平放于 白纸上，靠刀面较光滑面向下，较皱褶的一面向上。
五、材料出现裂隙、破碎或脱落。
原因：1.脱水不干净；2.透明剂残留；3.石蜡透入时温度过高； 4.材料太硬或太粗。
补救办法： 1.无法补救；2.重新包埋；3.无法补救；如由于脱 水剂，透明剂引起的可改用正丁醇，松油醇等进行脱水和透明； 4.软化组织。
二、实验步骤（7）
贴片：
要求：1）贴附牢固，在染色时不易脱落；2）使皱褶的蜡片伸展平整 步骤： 1）在载玻片上涂上蛋白黏贴剂；
染色原理－－化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸 性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于 着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大，易于着色。
常用染色剂分类
按染料的化学性质可分为 ：碱性染料 、酸性染料 、直接染料 、媒染 染料 、中性染料； 根据染料的来源可分为：天然染料（此类染色剂是从动、植物体中提取 的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝 等）和合成染料（全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最 早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料）。 根据染料的用途可分为：细胞核染色剂（用于细胞核的染色剂有天然染 色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺 蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等）、细胞质染色剂（用于细胞质 的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和 水溶性苯胺蓝等）和脂质染色剂（用于显示脂质的染色剂有合成染色剂 中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等）。


2）将已经涂好蛋白黏贴剂的载玻片放在纸面上，并滴加数滴蒸馏水；
3）用刀片将蜡带切成许多小段，每段的长度应依照盖玻片的长度为准， 一般应比盖玻片短约1/5-2/5，因蜡片加温后要伸长1/5-2/5，在分段时应 从蜡片的交界处分开； 4）用毛笔将蜡片轻轻移到载玻片上（必须注意蜡片的光面朝下）； 5）将载玻片平行地放置在酒精灯的上方，微热，使切片伸展摊平，如 发现散开，请重新用镊子排列整齐； 6）晾干待用。
切片注意事项：
操作时一定要小心，随时注意关好停刀轧，以防刀夹突然下降伤 及手指，在换蜡块时，必须先关停刀轧，才能取下蜡块；
切片时不要对着蜡带讲话，要防风，以免将蜡带吹散； 根据材料要求，注意调节合适的切片厚度； 切片完毕后，将刀取下擦净，放入盒内保存，同时用毛笔清洁切 片机各部分，将刀架、夹物器等退回原处固定。
甲醛－醋酸－酒精液(FAA) 50%或70％酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是 组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳 类的固定。
二、实验步骤（1）
取材（根据制片目的和要求而定，代表性）； 杀死和固定： 冲洗 小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用70%或50%AL进行冲洗； 植物叶片经FAA固定液后使用流水进行冲洗 50% 70% 80% 95% 100%AL 100%AL 小鼠利用引颈致死法迅速杀死，取其肝脏，用生理盐水冲洗干净后分割成 0.5~1cm×0.5~1cm×0.3cm 小块投入Bouin’s固定液中进行固定； 植物叶片采集后分割成1~1.5c㎡小块后投入FAA固定液中进行固定；
染色原理－－物理作用
渗透作用：染料渗透到多孔的组织中，与组织没有牢固的结合；
吸收作用：又称溶解学说，组织吸收染料中的色素粒子，与之牢 固结合，组织着色与染液的颜色相同，不一定与干燥染料的颜色 相同。如品红在干燥时为绿色，而其溶液呈红色，组织在染色后 也呈红色，即使组织干燥后，其红颜色不变； 吸附作用：染液中分散的色素粒子进入被染物质的粒子间隙内， 由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色，也由于各种蛋白 质或胶体有不同的吸附面，因此可以吸附不同的粒子，也就是说 对粒子的吸附有选择性，即有的容易被某些物质吸附，有的则不 容易吸附。
石蜡切片法
—— 染色、封藏
实验原理

切片通过不同方法，使其干燥，然后进行染色。因为每
一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲苯去除石 蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才能染色，染色 的方法很多，要根据每张标本要求显示的目的选择不同 的染剂，染色后显示清晰的细胞形态和核的大小，位置， 然后使带水的载片经历脱水→透明等步骤最后用树胶封 片。
脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果：
（1）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透 入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。 （2）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状 ，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。

太多或太少；③正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。
三、实验步骤（5）
切片：用锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片， 一般用专门的切片机和切片刀。 切片机的结构： 控制切片厚薄的微动装置； 供装切片刀的夹刀部分；
供装置组织块的夹物部分。 切片机的类型根据结构分为： 滑行式切片机：夹刀部分是滑动的，而夹物部分是固定的，可上 下升降； 旋转式切片机：夹物部分式上下移动，前后推进，而夹刀部分则 固定不变。