PCR介导的定点突变与随机突变的应用
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随 机 突 变 ＰＣＲ 的 优 点 之 一 是 在 无 需 分 离 克 隆和获得序列信息的情况下， 可以对核酸群体进 行重复随机突变。得到突变体库以后筛选出有特 殊性质的个体， 该个体还可直接用作第二次突变
ＰＣＲ 的模板， 连续反复地进行随机诱变， 使每一次 获得的小突变累积而发生重要的有益突变。
［参考文献］
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 克隆载体、目的基因和菌株 载体为 ｐＢ－ ＳＫ＋质粒 ＤＮＡ。基因克隆的重组质粒由美国麻省大 学 Ｉｏｒｉｏ 博士惠赠。新城疫病毒融合蛋白基因被插 入 ＸｈｏⅠ切点（ ６６８） ； 副流感病毒融合蛋白基因被 插入 ＢａｍＨⅠ切点（ ７１９） 。大肠杆菌 ＴＧ１ 由本室保 存。 １．１．２ 试 剂 Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ ５ Ｕ／μｌ， ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０１ＡＭ） ； 常规 １０×Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶缓 冲 液 ； ｄＮＴＰ 混 合 物 ； 天 然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ Ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｓ 公司， ＃ＥＰ０２８１） 或 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶； 自配１０×致突变 ＰＣＲ 缓冲液： ７０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， ０．１％（ｗ／ｖ）明胶。１０×ｄＮＴＰ 混合物： ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ， ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＣＴＰ 和 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ。５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２ （ 事 先 不 要 与 １０×致 突 变
ＰＣＲ 缓冲液混合， 否则会导致沉淀产生， 妨碍 ＰＣＲ 反应） 。 １．１．３ 定点突变引物 ①两对引物 （ 共 ４ 个） ， 每 对引物分别用于各自 ＰＣＲ 反应。每一引物约含有 ２４ 个与另一对引物中相应引物互补的核苷酸；② 测序引物， 在突变部位或插入部位的两侧， 用于分 析生成的构建体。所有引物均由上海生物工程有 限公司合成。 １．２ 方法 １．２．１ 定点突变方法［２］ 重组 ＰＣＲ 进行定点突变 的过程见图 １。引物由带数字的箭头表示。突出部 分代表错配碱基及 ＰＣＲ 产物中产生的突变。引物 １ 和引物 ３ 互补， 引物 ２ 和引物 ４ 互补。两种单一 限制性内切酶位点用于使质粒线性化。如要进行 另外的单一特异位点的突变， 只需合成新的引物 １ 和引物 ３， 可用同一种经酶切割的模板。５０ μｌ ＰＣＲ 反应体系中含 ２ ｎｇ 线性化的质粒 ＤＮＡ， 每种 引物 ２５ ｐｍｏｌ， 各种 ｄＮＴＰ ２００ μｍｏｌ／Ｌ， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合酶 １．２５ Ｕ， １×ＰＣＲ 缓冲液， 在 反 应 体 系 表 面 加 ３０ μｌ 矿物油。ＰＣＲ 反应参数： 起始变性温度 ９４ ℃ １ ｍｉｎ， 循环条件（ 每 ｋｂ 长度的 ＰＣＲ 产物） 为 ９４ ℃ ３０ ｓ， ５０ ℃ ３０ ｓ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ， 进行 １４～２０ 次循环。 循环结束后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎ。用琼脂糖凝胶电泳 检 查 ＰＣＲ 产 物 。 从 两 个 ＰＣＲ 反 应 管 中 各 取 出 ３ μｌ ＰＣＲ 反应产物， 混匀后用 ＣａＣｌ２ 转化法转化至 感受态大肠杆菌中。涂平板后， 从转化的细菌菌落 中随机挑选若干， 接种于含氨苄青霉素的 ２×ＹＴ 培养基中， ３７ ℃震荡培养， 进一步扩增。提取质粒
２结果
对副粘病毒融合蛋白进行的突变研究表明， 定 点 突 变 的 成 功 率 为 １００％； 随 机 突 变 （ ５００ 核 苷 酸 长度的靶 ＤＮＡ） 产生的突变群体中约 ４％为野生 型、１２％为含有 １ 个错误的突变体、２０％为 ２ 个错 误的突 变 体 、２２％为 ３ 个 错 误 的 突 变 体 、１８％为 ４ 个错误的突变体、１２％为 ５ 个错误的突变体、１２％ 为 ６ 个或更多错误的突变体。
３．１ 定 点 突 变 体 外 定 点 突 变 技 术 是 一 种 功 能 强大的方法， 可用于对蛋白质功能的研究， 确定酶 的活性位点， 以及在药物筛选中设计新的蛋白等。 ＰＣＲ 介导产生定点突变体的设计与传统的定点突 变方法不同， 它无需单链 ＤＮＡ 中间物， 回避了使 用 Ｍ１３ 系 列 噬 菌 体 载 体 及 其 他 辅 助 病 毒 制 备 单 链 ＤＮＡ 的过程［３］， 从而缩短了实验所需要的时间。
任桂杰， 等 ． ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
８６７ຫໍສະໝຸດ Baidu
合酶进行不正确拷贝时随机引入突变。通过调整 核苷酸、酶及镁离子的用量， 获得无序列倾向性的 突变体库。
随机突变 ＰＣＲ 应使用 ｃＤＮＡ 或仅含有目的序 列的双链 ＤＮＡ 片段作模板， 一般不用质粒 ＤＮＡ， 也不用基因组 ＤＮＡ。随机突变 ＰＣＲ 方 法 对 模 板 ＤＮＡ 的长度限制在约 １０００ 核苷酸。对于较长靶 ＤＮＡ 的突变， 可将其分为若干片段分别进行。
［５］ Ｆｒｅｉｔａｓ Ａ， Ｆｉｏｒｅ ＬＡ， Ｇｒｏｎｉｃｈ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｖｉｄｅｏ－ＥＥＧ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ［Ｊ］． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ （Ｒｉｏ Ｊ） ， ２００３， ７９： ２５９． ［６］ Ｐａｏｌｉｃｃｈｉ ＪＭ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎｏｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ
［３］ 颜子颖， 王海林， 译． 金冬雁， 校． 精编分子生物学实验 指南［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ２５２－２５３． ［收稿日期 ２００４－１２－０６］
（编辑：孙玉芝）
（上接第 ８６２ 页）
［２］ 肖 波 ， 王 晓 云 ， 叶 晖 ， 等 ． 电 视 录 像 脑 电 图 在 癫 痫 及 其 他 发 作 性 疾 病 中 的 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 华 神 经 科 杂 志 ， ２００２， ３５： ３４５．
［３］ 王 纪 文 ， 李 保 敏 ， 孙 若 鹏 ， 等． 儿 童 癫 痫 视 频 脑 电 图 监 测 及 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 国 实 用 儿 科 杂 志 ， ２００３， １８： ２２１．
［４］ 张文渊． 有关睡眠分期以及便携式、动态和视频脑 电 图等问题［Ｊ］．临床神经电生理学杂志， ２００１， １０： １８７．
３讨论
４３ 卷 ９ 期
图 １ 重组 ＰＣＲ 定点突变示意图
１．２．２ 随机突变方法［２］ 在预突变区域的两端按 常规方法设计引物， 为克隆方便也可在引物中加 入限制酶切位点。每 １００ μｌ 反应体系中， 分别加 入 １０ μｌ １０×致 突 变 ＰＣＲ 缓 冲 液 ， １０ μｌ １０×ｄＮＴＰ 混合物， 各种引物 ３０ ｐｍｏｌ 及 ＤＮＡ 模板 ２０ ｐｍｏｌ， 加入适量水使总体积为 ８８ μｌ， 混匀。加入 １０ μｌ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２， 混合均匀， 确证无沉淀产生后加 ５Ｕ 天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶， 使终体积为 １００ μｌ。混匀， 上层可覆盖矿物油或 ｗａｘ ｂｅａｄ。ＰＣＲ 循环 ３０ 次， 循环条件为： ９４ ℃ １ ｍｉｎ， ４５ ℃ １ ｍｉｎ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ。 不要进行热启动， 循环结束后也不要延长延伸时 间。氯仿／异戊醇（ ２４：１， Ｖ／Ｖ） 抽提后进行乙醇沉淀 以纯化 ＰＣＲ 产物。取少量纯化产物做琼脂糖凝胶 电泳分析， 证实获得满意量的全长 ＰＣＲ 产物。为 了比较全长 ＤＮＡ 的产量， 可将致突变 ＰＣＲ 和标 准 ＰＣＲ 同时进行， 然后电泳鉴定。将 ＰＣＲ 产物克 隆到适当载体后， 建立突变体库。从突变体库中筛 选出所需的突变体送公司测序， 确定突变体。
已 有 研 究 证 明［２］， 含 有 短 同 源 末 端 的 ＤＮＡ 片 段可以在 Ｅ．ｃｏｌｉ 胞内进行分子间重组， 即 ＰＣＲ 产 生的同源末端可通过体内重组使 ＤＮＡ 连在一起， 形成环状重组体。如果环状重组体分子含有复制 序列和选择标记， 那么这种重组体则更易于筛选。
点突变引物通常为 ２５～３５ 个核苷酸， 突变的 位置一般放在引物的中间。无突变的引物一般长 度为 ２０～３０ 个核苷酸。两种 ＰＣＲ 引物的末端最好 有 ２４ 个左右的同源核苷酸。突变体的设计最好是 消除或产生一个限制酶识别位点， 以便有效地筛 选出突变产物。此种定点突变方法构建的目的产 物特异性高， 但转化率低， 平均每纳克 ＤＮＡ 只产 生 １０ 个带突变的克隆。因此需用高度感受态的大 肠 杆 菌 （ 转 化 效 率 ＞１ ×１０９ 转 化 子 ／μｇ 单 体 ｐＵＣ１９） 。如果没有高度感受态的大肠杆菌， 那么 转化后 ３７ ℃复苏 １ ｈ， 可将全部样品涂在平板上， 可以提高筛选的效率， 节省实验时间。
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（ Ｎｏ．３０２７００６１） ［作者简介］ 任桂杰（ １９６９－ ） ， 女， 讲师， 主要从事分子病毒学的研究。 ［通讯作者］ 王志玉， Ｔｅｌ： ０５３１－８８３８０４１８．
８６６
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版）
ＤＮＡ， 酶切或双酶切反应初步鉴别突变株。然后送 公司测序， 进一步确定突变株。
［１］ 黄 培 堂 ， 王 嘉 玺 ， 朱 厚 础 ， 等 译 ． 分 子 克 隆 实 验 指 南 ［Ｍ］ ． 北京： 科学出版社， ２００３． １ ０８０－１ ０８７．
［２］ 黄 培 堂 ， 俞 炜 源 ， 陈 添 弥 ， 等 译 ． ＰＣＲ 技 术 实 验 指 南 ［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ４１６－４２５．
任桂杰 １， ２ ， 王志玉 １
（ 山东大学 １．公共卫生学院病毒学研究室； ２．医学院生化与分子生物学研究所，山东 济南 ２５００１２）
［关键词］ 聚合酶链反应；定点突变；随机突变 ［中图分类号］ Ｑ７５４ ［文献标识码］ Ｂ
蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质 组学研究的重点内容之一。体外突变技术是研究 这种复杂关系的有力工具， 也是实验室中改造／优 化基因常用的手段［１］。定点突变技术可对某个已知 基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入； 随 机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随 机的突变体。我们现介绍两种在实验中总结出来 的用 ＰＣＲ 方法对克隆化 ＤＮＡ 进行定点突变和随 机突变的技术。
ｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］． Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ， ２００２， ４３（Ｓｕｐｐｌ ３）： ６０． ［７］ Ｄｅｒｉｃｉｏｇｌｕ Ｎ， Ｓａｙｇｉ Ｓ， Ｃｉｇｅｒ Ａ． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎ
ＰＣＲ 扩增反应之前， 需用两种限制性内切酶 在质粒待扩增区域的两侧， 分别将模板质粒线性 化， 进行两次 ＰＣＲ 并引入突变。一般利用原始质 粒上单一酶切位点， 这样在插入物上任何位点进 行 突 变 时 ， 都 可 以 用 这 两 种 线 性 模 板 。超 螺 旋 的 ＤＮＡ 分 子 也 可 作 为 ＰＣＲ 的 模 板 ， 但 ＰＣＲ 产 物 必 需 经 过 纯 化 使 其 与 质 粒 模 板 分 开 （超 螺 旋 质 粒 转 化 效 率 非 常 高 ） 。由 于 超 螺 旋 模 板 的 ＰＣＲ 产 物 量 低 ， 因 此，超 螺 旋 质 粒 作 ＰＣＲ 模 板 时 要 进 行 多 次 的扩增循环。 ３．２ 随机突变 如果突变在长 ＤＮＡ 片段及在完 整基因中进行， 则更倾向于采用在整个序列中进 行散在的随机突变， 每一分子出现一个或数个突 变。由于天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶不具备 ３＇ →５＇ 外切 酶活性， 在链延伸过程中不可避免地存在一定的 核苷酸错误掺入， 所以可在 ＰＣＲ 中通过 ＤＮＡ 聚
第 ４３ 卷第 ９ 期 ２００５ 年 ９ 月
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ ＨＥＡＬＴＨ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）
文章编号： １６７１－ ７５５４（２００５）０９－ ０８６５－ ０３
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．９ Ｓｅｐｔ．２００５
ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
ＰＣＲ 的模板， 连续反复地进行随机诱变， 使每一次 获得的小突变累积而发生重要的有益突变。
［参考文献］
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 克隆载体、目的基因和菌株 载体为 ｐＢ－ ＳＫ＋质粒 ＤＮＡ。基因克隆的重组质粒由美国麻省大 学 Ｉｏｒｉｏ 博士惠赠。新城疫病毒融合蛋白基因被插 入 ＸｈｏⅠ切点（ ６６８） ； 副流感病毒融合蛋白基因被 插入 ＢａｍＨⅠ切点（ ７１９） 。大肠杆菌 ＴＧ１ 由本室保 存。 １．１．２ 试 剂 Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ ５ Ｕ／μｌ， ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０１ＡＭ） ； 常规 １０×Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶缓 冲 液 ； ｄＮＴＰ 混 合 物 ； 天 然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ Ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｓ 公司， ＃ＥＰ０２８１） 或 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶； 自配１０×致突变 ＰＣＲ 缓冲液： ７０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， ０．１％（ｗ／ｖ）明胶。１０×ｄＮＴＰ 混合物： ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ， ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＣＴＰ 和 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ。５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２ （ 事 先 不 要 与 １０×致 突 变
ＰＣＲ 缓冲液混合， 否则会导致沉淀产生， 妨碍 ＰＣＲ 反应） 。 １．１．３ 定点突变引物 ①两对引物 （ 共 ４ 个） ， 每 对引物分别用于各自 ＰＣＲ 反应。每一引物约含有 ２４ 个与另一对引物中相应引物互补的核苷酸；② 测序引物， 在突变部位或插入部位的两侧， 用于分 析生成的构建体。所有引物均由上海生物工程有 限公司合成。 １．２ 方法 １．２．１ 定点突变方法［２］ 重组 ＰＣＲ 进行定点突变 的过程见图 １。引物由带数字的箭头表示。突出部 分代表错配碱基及 ＰＣＲ 产物中产生的突变。引物 １ 和引物 ３ 互补， 引物 ２ 和引物 ４ 互补。两种单一 限制性内切酶位点用于使质粒线性化。如要进行 另外的单一特异位点的突变， 只需合成新的引物 １ 和引物 ３， 可用同一种经酶切割的模板。５０ μｌ ＰＣＲ 反应体系中含 ２ ｎｇ 线性化的质粒 ＤＮＡ， 每种 引物 ２５ ｐｍｏｌ， 各种 ｄＮＴＰ ２００ μｍｏｌ／Ｌ， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合酶 １．２５ Ｕ， １×ＰＣＲ 缓冲液， 在 反 应 体 系 表 面 加 ３０ μｌ 矿物油。ＰＣＲ 反应参数： 起始变性温度 ９４ ℃ １ ｍｉｎ， 循环条件（ 每 ｋｂ 长度的 ＰＣＲ 产物） 为 ９４ ℃ ３０ ｓ， ５０ ℃ ３０ ｓ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ， 进行 １４～２０ 次循环。 循环结束后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎ。用琼脂糖凝胶电泳 检 查 ＰＣＲ 产 物 。 从 两 个 ＰＣＲ 反 应 管 中 各 取 出 ３ μｌ ＰＣＲ 反应产物， 混匀后用 ＣａＣｌ２ 转化法转化至 感受态大肠杆菌中。涂平板后， 从转化的细菌菌落 中随机挑选若干， 接种于含氨苄青霉素的 ２×ＹＴ 培养基中， ３７ ℃震荡培养， 进一步扩增。提取质粒
２结果
对副粘病毒融合蛋白进行的突变研究表明， 定 点 突 变 的 成 功 率 为 １００％； 随 机 突 变 （ ５００ 核 苷 酸 长度的靶 ＤＮＡ） 产生的突变群体中约 ４％为野生 型、１２％为含有 １ 个错误的突变体、２０％为 ２ 个错 误的突 变 体 、２２％为 ３ 个 错 误 的 突 变 体 、１８％为 ４ 个错误的突变体、１２％为 ５ 个错误的突变体、１２％ 为 ６ 个或更多错误的突变体。
３．１ 定 点 突 变 体 外 定 点 突 变 技 术 是 一 种 功 能 强大的方法， 可用于对蛋白质功能的研究， 确定酶 的活性位点， 以及在药物筛选中设计新的蛋白等。 ＰＣＲ 介导产生定点突变体的设计与传统的定点突 变方法不同， 它无需单链 ＤＮＡ 中间物， 回避了使 用 Ｍ１３ 系 列 噬 菌 体 载 体 及 其 他 辅 助 病 毒 制 备 单 链 ＤＮＡ 的过程［３］， 从而缩短了实验所需要的时间。
任桂杰， 等 ． ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
８６７ຫໍສະໝຸດ Baidu
合酶进行不正确拷贝时随机引入突变。通过调整 核苷酸、酶及镁离子的用量， 获得无序列倾向性的 突变体库。
随机突变 ＰＣＲ 应使用 ｃＤＮＡ 或仅含有目的序 列的双链 ＤＮＡ 片段作模板， 一般不用质粒 ＤＮＡ， 也不用基因组 ＤＮＡ。随机突变 ＰＣＲ 方 法 对 模 板 ＤＮＡ 的长度限制在约 １０００ 核苷酸。对于较长靶 ＤＮＡ 的突变， 可将其分为若干片段分别进行。
［５］ Ｆｒｅｉｔａｓ Ａ， Ｆｉｏｒｅ ＬＡ， Ｇｒｏｎｉｃｈ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｖｉｄｅｏ－ＥＥＧ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ［Ｊ］． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ （Ｒｉｏ Ｊ） ， ２００３， ７９： ２５９． ［６］ Ｐａｏｌｉｃｃｈｉ ＪＭ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎｏｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ
［３］ 颜子颖， 王海林， 译． 金冬雁， 校． 精编分子生物学实验 指南［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ２５２－２５３． ［收稿日期 ２００４－１２－０６］
（编辑：孙玉芝）
（上接第 ８６２ 页）
［２］ 肖 波 ， 王 晓 云 ， 叶 晖 ， 等 ． 电 视 录 像 脑 电 图 在 癫 痫 及 其 他 发 作 性 疾 病 中 的 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 华 神 经 科 杂 志 ， ２００２， ３５： ３４５．
［３］ 王 纪 文 ， 李 保 敏 ， 孙 若 鹏 ， 等． 儿 童 癫 痫 视 频 脑 电 图 监 测 及 诊 断 价 值 探 讨 ［Ｊ］． 中 国 实 用 儿 科 杂 志 ， ２００３， １８： ２２１．
［４］ 张文渊． 有关睡眠分期以及便携式、动态和视频脑 电 图等问题［Ｊ］．临床神经电生理学杂志， ２００１， １０： １８７．
３讨论
４３ 卷 ９ 期
图 １ 重组 ＰＣＲ 定点突变示意图
１．２．２ 随机突变方法［２］ 在预突变区域的两端按 常规方法设计引物， 为克隆方便也可在引物中加 入限制酶切位点。每 １００ μｌ 反应体系中， 分别加 入 １０ μｌ １０×致 突 变 ＰＣＲ 缓 冲 液 ， １０ μｌ １０×ｄＮＴＰ 混合物， 各种引物 ３０ ｐｍｏｌ 及 ＤＮＡ 模板 ２０ ｐｍｏｌ， 加入适量水使总体积为 ８８ μｌ， 混匀。加入 １０ μｌ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２， 混合均匀， 确证无沉淀产生后加 ５Ｕ 天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶， 使终体积为 １００ μｌ。混匀， 上层可覆盖矿物油或 ｗａｘ ｂｅａｄ。ＰＣＲ 循环 ３０ 次， 循环条件为： ９４ ℃ １ ｍｉｎ， ４５ ℃ １ ｍｉｎ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ。 不要进行热启动， 循环结束后也不要延长延伸时 间。氯仿／异戊醇（ ２４：１， Ｖ／Ｖ） 抽提后进行乙醇沉淀 以纯化 ＰＣＲ 产物。取少量纯化产物做琼脂糖凝胶 电泳分析， 证实获得满意量的全长 ＰＣＲ 产物。为 了比较全长 ＤＮＡ 的产量， 可将致突变 ＰＣＲ 和标 准 ＰＣＲ 同时进行， 然后电泳鉴定。将 ＰＣＲ 产物克 隆到适当载体后， 建立突变体库。从突变体库中筛 选出所需的突变体送公司测序， 确定突变体。
已 有 研 究 证 明［２］， 含 有 短 同 源 末 端 的 ＤＮＡ 片 段可以在 Ｅ．ｃｏｌｉ 胞内进行分子间重组， 即 ＰＣＲ 产 生的同源末端可通过体内重组使 ＤＮＡ 连在一起， 形成环状重组体。如果环状重组体分子含有复制 序列和选择标记， 那么这种重组体则更易于筛选。
点突变引物通常为 ２５～３５ 个核苷酸， 突变的 位置一般放在引物的中间。无突变的引物一般长 度为 ２０～３０ 个核苷酸。两种 ＰＣＲ 引物的末端最好 有 ２４ 个左右的同源核苷酸。突变体的设计最好是 消除或产生一个限制酶识别位点， 以便有效地筛 选出突变产物。此种定点突变方法构建的目的产 物特异性高， 但转化率低， 平均每纳克 ＤＮＡ 只产 生 １０ 个带突变的克隆。因此需用高度感受态的大 肠 杆 菌 （ 转 化 效 率 ＞１ ×１０９ 转 化 子 ／μｇ 单 体 ｐＵＣ１９） 。如果没有高度感受态的大肠杆菌， 那么 转化后 ３７ ℃复苏 １ ｈ， 可将全部样品涂在平板上， 可以提高筛选的效率， 节省实验时间。
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（ Ｎｏ．３０２７００６１） ［作者简介］ 任桂杰（ １９６９－ ） ， 女， 讲师， 主要从事分子病毒学的研究。 ［通讯作者］ 王志玉， Ｔｅｌ： ０５３１－８８３８０４１８．
８６６
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版）
ＤＮＡ， 酶切或双酶切反应初步鉴别突变株。然后送 公司测序， 进一步确定突变株。
［１］ 黄 培 堂 ， 王 嘉 玺 ， 朱 厚 础 ， 等 译 ． 分 子 克 隆 实 验 指 南 ［Ｍ］ ． 北京： 科学出版社， ２００３． １ ０８０－１ ０８７．
［２］ 黄 培 堂 ， 俞 炜 源 ， 陈 添 弥 ， 等 译 ． ＰＣＲ 技 术 实 验 指 南 ［Ｍ］． 北京： 科学出版社， １９９８． ４１６－４２５．
任桂杰 １， ２ ， 王志玉 １
（ 山东大学 １．公共卫生学院病毒学研究室； ２．医学院生化与分子生物学研究所，山东 济南 ２５００１２）
［关键词］ 聚合酶链反应；定点突变；随机突变 ［中图分类号］ Ｑ７５４ ［文献标识码］ Ｂ
蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质 组学研究的重点内容之一。体外突变技术是研究 这种复杂关系的有力工具， 也是实验室中改造／优 化基因常用的手段［１］。定点突变技术可对某个已知 基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入； 随 机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随 机的突变体。我们现介绍两种在实验中总结出来 的用 ＰＣＲ 方法对克隆化 ＤＮＡ 进行定点突变和随 机突变的技术。
ｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］． Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ， ２００２， ４３（Ｓｕｐｐｌ ３）： ６０． ［７］ Ｄｅｒｉｃｉｏｇｌｕ Ｎ， Ｓａｙｇｉ Ｓ， Ｃｉｇｅｒ Ａ． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎ
ＰＣＲ 扩增反应之前， 需用两种限制性内切酶 在质粒待扩增区域的两侧， 分别将模板质粒线性 化， 进行两次 ＰＣＲ 并引入突变。一般利用原始质 粒上单一酶切位点， 这样在插入物上任何位点进 行 突 变 时 ， 都 可 以 用 这 两 种 线 性 模 板 。超 螺 旋 的 ＤＮＡ 分 子 也 可 作 为 ＰＣＲ 的 模 板 ， 但 ＰＣＲ 产 物 必 需 经 过 纯 化 使 其 与 质 粒 模 板 分 开 （超 螺 旋 质 粒 转 化 效 率 非 常 高 ） 。由 于 超 螺 旋 模 板 的 ＰＣＲ 产 物 量 低 ， 因 此，超 螺 旋 质 粒 作 ＰＣＲ 模 板 时 要 进 行 多 次 的扩增循环。 ３．２ 随机突变 如果突变在长 ＤＮＡ 片段及在完 整基因中进行， 则更倾向于采用在整个序列中进 行散在的随机突变， 每一分子出现一个或数个突 变。由于天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶不具备 ３＇ →５＇ 外切 酶活性， 在链延伸过程中不可避免地存在一定的 核苷酸错误掺入， 所以可在 ＰＣＲ 中通过 ＤＮＡ 聚
第 ４３ 卷第 ９ 期 ２００５ 年 ９ 月
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ ＨＥＡＬＴＨ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）
文章编号： １６７１－ ７５５４（２００５）０９－ ０８６５－ ０３
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．９ Ｓｅｐｔ．２００５
ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用