二. 细菌的简单染色和革兰氏染色
1.革兰氏染色中那一步是关键 ?为什么？你是如何操作的？
革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误
认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间
的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是
应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。
2.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？
自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
3.不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？
能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4.涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？
a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；
b 增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过 3 次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三. 霉菌、放线菌的形态观察
1.镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？
一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而
断裂成球状或杆状小体。
2.显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。
细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。（部分杆菌还可形成芽孢）放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。
霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。
四. 玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌
1. 高压蒸汽灭菌开始时为什么要将锅内排尽？灭菌后为什么要待压力降低到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物？
因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到0 时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的
培养基由于内外压力不平衡（压力突然下降而发生复沸腾）而冲出烧瓶口或试管口，造成培养基等液体沾
湿棉塞或溢出等事故。
2.设计实验方案，比较干热灭菌和湿热灭菌的效果。
以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件和等量原则。
（一）实验材料
试管镊子酒精灯嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 7053 菌片纸片（与菌片同大小同材料）溴甲酚紫蛋白冻
水培养基（已灭菌）等实验材料（材料有余）。
（二）对照组
取 9 支洁净试管，分为A1 B1 C1三组（每3支一组），将A1组中放入菌片，B1 组中放入纸片， C1 组中什么也不加；不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）。
（三）恒为培养
将上述所有试管按分组在56℃恒温条件下培养48 小时。
3. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长？
在湿热条件下，有水蒸汽的作用：
a高温水蒸汽导热比干空气要快；
b高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；
c高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；
c高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热。
（湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的穿透力
比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在，每 1 克水在 100 ℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。）
五. 培养基的配置
1.配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？
称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面
易出错的步骤有：
a 称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水的药品要快速称取；
b 加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基
因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。）；
c 分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管）口，以免接种时染菌；
d 搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜。
2.配制培养基的一般原则是什么？
a 目的明确
b 营养协调
c 理化适宜
d 经济节约
六. 平板菌落计数法
1.平板菌落计数法的原理是什么 ? 它适用于那些微生物的计数？
平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液
接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品
中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。（但是，由于
待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位）。
平板计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个微生物繁殖而形成的现象进行
的，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对)。通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细
胞微生物的数量。
2.菌落样液移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？
出现的结果是：形成菌落过于集中，不能形成均匀分布的单菌落，导致无法计数。
因为：若不立即摇匀，菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。
3.要获得本次试验的成功，那几步最为关键？为什么？
a 稀释菌液若在稀释时移液管混用可使稀释梯度不准确，从而导致计数误差（放菌液时吸管尖不要碰
到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差大。）；
b 稀释倒平板 1 若再加入菌液不立即倒入培养基，可使菌体黏附于皿底；
2若不注意培养基温度，温度过高会将菌体烧死，温度过低会使培养基一倒入立即凝固，
从而菌体不能均匀分布；
3倒入培养基需立即摇匀，否则菌体常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从
而影响计数的准确性；
4选择倒平板的稀释梯度也是很重要的，一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板
后所出现的平均菌落数在 50 个左右为宜，否则要适当增加（或减少）稀释度加以调整。
4.平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比有何优缺点？
