ENU与疾病动物模型

♀ 0
合计 0 33.2±12.1 34.6±8.7
(193/242) 79.8 25.39 17.62 (83/193) 43.01
角膜浑浊小鼠后代的性别比(♂:♀)为：1.07 有角膜浑浊表型的性别比(♂:♀)为：1.44
B6和角膜浑浊后代正常和异常表型生长发育曲线 40 35 30 25 20 15 10 5 0
体重（g）
B6 B6-Con B6-Coa
初 生
5
10
15
20
25
30
40
50
日龄（天）
60
B6-Co与正常B6小鼠的脏器系数
组别 心 肝 肺 脾 肾 脑 睾丸 子宫 卵巢 正常B6♂ 0.595± 0.045 4.680± 0.373 0.635± 0.060 0.280± 0.063 1.465± 0.105 2.087± 0.142 0.854± 0.077 正常B6♀ 0.572± 0.029 4.765± 0.456 0.745± 0.089 0.368± 0.028 1.416± 0.083 2.484± 0.153 0.483± 0.099 0.080± 0.010 角膜浑浊♂ 0.586± 0.066 4.719± 0.294 0.686± 0.037 0.223± 0.041 1.473± 0.086 2.560± 0.246* 0.863± 0.081 角膜浑浊♀ 0.557± 0.029 4.570± 0.307 0.761± 0.051 0.355± 0.066 1.443± 0.086 2.670± 0.257 0.282± 0.052* 0.061± 0.024
特点：基因结构明确； 时间长，代价高，
效率低。
诱导点突变——表型驱动
特点：高通量，大规模，表型明确；随机。
小鼠在人类遗传病研究中的独特作用
小鼠是第二个完成全基因组测序的哺乳动物。 人类疾病有关的遗传基因中的90%在小鼠身上有相似的
效果。
小鼠容易获得，世代间隔短，饲养、管理、实验操作方 便。 小鼠是研究人类疾病和基因功能的最为理想的模式动物， 成为研究人类疾病和试验新的治疗手段的理想模型。
筛查 G1 小鼠 1650只，获得突变小鼠 48 只。
在对G1突变小鼠的遗传试验及突变系小鼠保种
过程中，繁殖小鼠1468只，确认能够稳定遗传的
只有短尾、角膜浑浊和瞳孔异形突变小鼠等共 7 种，经卡方检验都属于单基因显性遗传。
突变基因的微卫星定位体系
• D1Mit372、D1Mit84、D1Mit273、 D2Mit6、D2Mit17、D2Mit528、 D3Mit268、D3Mit15、D4Mit17、 D4Mit54、D5Mit352、D5Mit168、 D6Mit274、D6Mit339、 D7Mit246、D7Mit333、D8Mit4、 D8Mit320、D9Mit325、 D9Mit243、D10Mit3、D10Mit73、 D11Mit163、D11Mit258、 D12Mit136、D12Mit17、 D13Mit18、D13Mit262、 D14Mit50、D14Mit205、 D15Mit226、D15Mit34、 D16Mit189、D16Mit100、 D17Mit33、D17Mit39、 D18Mit52、D19Mit128、 D19Mit33。
角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血常规的比较
白细胞 （×109/L） 3.11±2.19 2.71±1.86 红细胞 (×1012/L） 7.64±3.10 8.37±0.48 中性粒细胞 （×109/L） 0.46±0.13 0.56±0.08 红细胞压积（%） 44.42±5.73 44.25±5.87 淋巴细胞 （×109/L） 5.04±1.83 5.27±0.98 血小板 (×109/L） 523.87±119.70 536.87±94.42* 单核细胞 （×109/L） 0.01±0.01 0.05±0.05 血红蛋白 （g/L） 140.60±9.66 135.27±5.68
F2代 B6角膜浑浊小鼠的微卫星检测
泳道1： 野生型D2品系小鼠对照； 泳道 2－17：F2角膜浑浊小鼠的检测结果，其中第9泳道发生重组，其余连锁。
角膜浑浊小鼠突变基因的连锁分析
角膜浑浊小鼠突变基因的染色体定位
F2代 短尾小鼠的微卫星检测
D17Mit33与D17Mit143聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
我们的部分研究工作
• 突变系小鼠的获得 • 两种突变小鼠突变基因的定位 • 两种突变小鼠模型性状的初步研究
ENU处理C57BL/6 雄鼠
3个月后与同品系 母鼠配种
ENU诱变、突变表型筛选及 遗传试验技术路线
子代小鼠（G1） 离乳 阳性突变小鼠G1
G1饲养至2月龄
同品系配种得G2
具有亲代G1突变表型
Baidu Nhomakorabea 国外进展
• 德国GSF 1997-2003年期间共建立突变系 小鼠267种，其中隐性突变50种，半显性突 变5种，其余均为显性突变； • 到2000年英国MRC筛查突变小鼠26000只， 得到突变系小鼠500种； • 到目前为止，世界上ENU诱变获得的突变 系小鼠已有1000多种。
国内进展
• 南京大学和扬州大学共同承担的“国家小鼠遗传 资源库”项目，其中一项重要工作就是开展小鼠 ENU诱变研究。2002-2004年资源库共建立了具 有自主知识产权的转基因/基因剔除/化学诱变小鼠 共167种，其中ENU诱变获得的有117种，在此基 础上克隆了7个突变基因。 • 清华大学生物科学与技术系发育生物学实验室用 ENU 诱导斑马鱼突变一共得到 35 种突变体 。
ENU诱变建立疾病动物模型
• 心血管疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、 免疫性疾病、肿瘤和出生缺陷等遗传高度 相关性疾病已成为国际上生物医学研究的 最热门领域，相应的实验动物学支撑，特 别是相关疾病的动物模型的获得和建立成 为了实验动物学研究的热点。
小鼠疾病模型的开发与保种
• 美国的Jackson实验室保存了近2500多个品 系的小鼠模型； • 英国MRC的哺乳类遗传学中心保存了1000 多个品系的小鼠资源； • 意大利的欧洲小鼠突变系保存中心每年以 开发150个突变系小鼠的速度建立了数百个 基因工程小鼠模型； • 日本的熊本大学实验动物资源开发研究中 心(CARD)自2000年建立以来，已收集保存 了700多个转基因和基因剔除小鼠模型。
ENU在建立人类疾病动物模型和 开展基因功能研究中的主要优势
• ①在相对短的时间内诱导产生较多的突变系小鼠， 获得许多基因包括新基因的功能信息； • ②只要得到能够遗传某种表型的突变小鼠，就可 以通过配种形成任意控制的“超大家系”； • ③小鼠近交系有数百种，其中12个品系的微卫星 数据已经建库且免费开放，便于对突变基因的定 位及克隆； • ④小鼠与人类病理过程的相似性，通过克隆小鼠 的致病基因就可以通过同源检索得到人类的相应 疾病的基因；
ENU诱变与疾病动物模型
邵义祥
人类遗传性疾病
人类群体中约20%～25%的人都患有不同种类、 不同程度的遗传相关疾病。
人类遗传学研究表明： 4～5%新生儿患有遗传
病，40%的低智能儿童是由遗传因素造成。
现代医学研究已证实：癌症、糖尿病、冠心病、
动脉粥样硬化、高血压病和精神分裂症等常见 病与遗传因素密切相关。
• 国家遗传工程小鼠资源库建立以来，已收 集、开发了264种小鼠模型品系。 模型种类包括：糖尿病模型、生殖缺陷模 型、心衰模型、生长迟缓模型、骨密度异 常模型、肢体发育缺陷模型、听力异常模 型、眼发育异常模型、稀毛、毛色变异模 型等等。
• 目前，世界上数以千计新的小鼠品系，模 拟人类代谢性疾病、自身免疫疾病、老年 性疾病和神经系统疾病的动物模型正在不 断通过ENU诱变这个高通量筛选技术建立 起来，进而相关基因被定位和克隆。随着 基因组计划的进行，从表型到基因克隆的 方法目前也日渐成熟和简化。
ENU诱变技术
随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基
因的定位也会随之变得容易，因此对小鼠进行化学
诱变将越来越变得低成本而高效益。
ENU（ethylnitrosourea）致突变技术是高通量大
规模筛选新基因及发育突变技术的化学诱变方法。
ENU诱变是一种表型诱变技术，研究者无需知道哪
个基因以及这些基因的突变类型，即可直接针对某
ENU诱变的历史和现状
• ENU诱变开始于上个世纪70年代，初期主 要应用在肿瘤研究领域； • 在1985年左右，开始有报道用ENU诱变雄 鼠而在后代当中获得突变系小鼠，这些突 变小鼠某些酶的活性发生了改变 ； • 1995年以后，开始在世界范围内得到开展 并主要用于基因功能的研究； • 1994年King等通过诱变获得生活规律异常 的小鼠，1997年克隆了clock基因，这是表 明ENU诱变技术独特优势的里程碑。
人类疾病动物模型的用途
由于个体遗传背景的差异及研究材料的限制，
人类遗传疾病的深入研究必须通过动物模型实
现。
利用动物模型进行遗传疾病机理的深入研究
借助动物模型进行实验性矫正或治疗
获得人类遗传病动物模型的方法
自发性动物模型
基因组改造和修饰
基因组诱变
基因驱动法与表型驱动法
基因敲除与插入——基因驱动
• screening and testing for recessive mutants
诱变小鼠的筛查项目
指标分类
一般状况 神经行为
具体指标
精神状态、体重、体形、营养状况 步态、摇头、转圈、震颤、活动状况
皮肤、毛发 皮色、皮质、毛色、毛质、胡须、斑点、淤斑、纹理 眼 耳 尾 骨骼 口腔 尿、粪 血生化 血常规 其它 位置、大小、形态、颜色、角膜、虹膜、有无白内障 耳廓位置、形态、大小、外耳道是否闭锁 长短、粗细、形态、颜色 头形、有无下颌、脊柱侧弯、四肢长短粗细、趾数多少，趾长短、并趾 牙齿长短、色质、质地、角度；舌的形态、色质；有无腭裂 尿液颜色、浑浊度；粪便颜色、质地 血糖、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮 白细胞数、红细胞数、血红蛋白、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋 白含量 水肿、脑积水、腹水、脊柱裂
上图：第4泳道发生重组 下图：无 1 例发生交换，12、13、14分别为D2、F1、B6
短尾鼠的突变基因连锁分析
228只F2 [（B6×D2）× D2] 109只短尾
短尾突变基因与各微卫星的连锁分析
短尾小鼠突变基因的染色体定位
角膜浑浊突变小鼠的生物学 特性初步研究
突变品系的建立及其模型性状 研究的技术路线
显性遗传
突变基因的定位技术路线
B6突变系与DBA/2交配，获得阳性表型的F1 F1回交 DBA得到F2代 提取阳性表型的F2鼠 尾DNA 选择相关基因附近的微卫星优先连锁分析
计算LOD值确定连锁
小 鼠 的 ENU 诱 变结果
在 G1 代小鼠中，针对肉眼可见的神经行为、皮 肤、毛发、五官、骨骼等可见表型筛查突变个体。
• ⑤ENU诱变无需知道哪个基因以及这些基因的何 种突变导致特定的表型或疾病，这也使得发现新 基因成为可能。 • ⑥ENU诱导的某些突变，导致非致死的表型和改 变蛋白质的部分功能，而不是完全废弃，因此增 加了研究者鉴定突变体的机会，而该突变体含有 对某个基因座的丰富信息。 总之，以ENU诱变为手段，通过模式小鼠研究功 能基因或人类疾病已成为一种很有前景的手段和 捷径。
一未知基因突变导致的特定表型或疾病进行研究
ENU的结构 （N-ethyl-N-nitrosourea）
ENU诱变机制
• 烷基化反应 • 作用位点：
A：N1、N3、N7 G：O6、N3、N7 C：O2、N3 T：O2、O4、N3 • 复制、错配、未修复导致单碱基突变
screening and testing for dominant mutants
突变杂合子
形 态 行 为 观 察
繁 殖 学 指 标
生 长 发 育
血 常
规
血 液 生 化
免 疫 学 指 标
病 理 组 化
建立新的模型品系
角膜浑浊小鼠
角膜浑浊小鼠和野生型小鼠的繁殖学指标比较
突变表型发生率（%） 品系 平均窝仔数 离乳成活率（%） 平均胎间隔(天）
♂ B6 B6-Co 6.33±2.06 6.02±2.00 (938/1092)85.9 0