小鼠骨髓微核试验培训资料

小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。

故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。

（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。

（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。

同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。

混匀后推片。

长度为2-3cm。

3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。

4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。

5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。

实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。

二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。

微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。

骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。

三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。

2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。

3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。

4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。

5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。

6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。

7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。

四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。

通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。

这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。

为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。

通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。

这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。

五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。

2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。

3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。

4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。

小鼠骨髓多染红细胞微核试验实验原理微核是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞浆内形成的游离团块物质。

微核实验作为细胞遗传损伤的标志之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。

当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排除，成为多染红细胞，这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血中。

在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。

由于这些细胞没有主核，便于观察微核。

观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。

本次试验的检测终点为染色体损伤。

一、实验动物健康的成年ICR小鼠50只，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，随机分组。

二、试剂与其器材40%工业久效磷，环磷酰胺，PH6.8的小牛血清，甲醇，PH6.8的磷酸缓冲液，Giemsa 染液；注射器、小鼠灌胃针头、动物秤、剪刀、镊子、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜。

三、试验方法1.实验动物：采用配伍组设计法对小鼠进行分组。

每组10只，共5组。

2.剂量分组：设置阳性对照及阴性对照组。

阳性对照物采用120mg/kg环磷酰胺，阴性对照物采用蒸馏水。

此外设计三个剂量组，分别为高中低剂量组。

通常取受试物LD50的1/2,1/4,1/8等剂量。

剂量分别为13.2mg/kg，6.6mg/kg，3.3mg/kg。

3.染毒途径：经口灌胃染毒。

4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。

5.取材：按照上述步骤染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。

用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。

6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定5分钟。

7.染色：用1:9的Giemsa-磷酸缓冲液（PH6.8）染色约10-15分钟，自来水冲洗后，自然干燥。

8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，在低倍镜下观察染色及分散情况。

小鼠骨髓细胞微核试验金一和大連理工大学環境与生命学院微核形成机理微核实验原理微核是染色体断裂或纺锤丝受损, 在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。

RBC在成熟之前最后一次细胞分裂后，主核排出细胞外，微核仍滞留在PCE细胞中。

因此，可以根据PCE细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性。

实验目的1.掌握小鼠骨髓细胞微核试验方法2.掌握骨髓多染红细胞（PCE）中微核的观察方法实验器材1.手术刀2.手术剪3.无齿镊4.小型弯止血钳5.干净纱布6.带橡皮头吸管7.台式离心机8.刻度离心管9.电吹风机10.玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头12.载玻片及推片13.定时钟14.带油镜头显微镜15.细胞计数器16.玻璃染色缸17.晾片架主要试剂甲醇（分析纯）生理盐水小牛血清pH6.8的磷酸盐缓冲液分别取1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。

阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C实验操作步骤•染毒次数连续 4 次染毒取样时间最后一次染毒后，经过24h，取骨髓制作骨髓涂片骨髓涂片的固定、染色和封片微核观察和细胞计数骨髓细胞染色方法取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清Giemsa 应用液10~15min 甲醇中，固定15min 混匀、推片冲洗、晾干晾干冲洗、晾干细胞计数嗜多染红细胞和微核微核率计算方法结果分析与评价阳性判断实验组中至少一个剂量组微核阳性率显著大于对照组，并具有重现性和剂量-反应关系。

阴性结果试验剂量不够、采样时间不合适、细胞计数量不足、实验动物自发微核率高等原因，均可以造成实验结果阴性。

当实验设计符合标准，试验剂量足够大，其他染毒方式的微核试验结果仍为阴性时，可认为受试物微核试验阴性。

注意事项1. 实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。

2. 骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。

1小鼠骨髓细胞微核试验(Bone marrow cell micronucleus test)⏹指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。

2微核(micronucleus ，MN)细胞核微核⏹细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片/环，也可以是纺锤体受损而丢失的整个染色体。

⏹它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。

⏹一般认为微核是细胞受到染色体断裂剂或纺锤体毒物作用的结果。

3微核(micronucleus ，MN)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验⏹嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte ，PCE)细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。

4⏹正染红细胞(normochromatic erythrocyte ，NCE)核糖体已消失的成熟红细胞。

为何选择PCE (polychromatic erythrocytes)⏹PCE ：指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出的细胞，而微核仍保留在细胞质中。

⏹微核可以出现在多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区别。

5为何选择PCE ？⏹PCE ：Giemsa 染色呈灰蓝色(胞质内含核糖体)⏹NCE(正染红细胞/成熟红细胞，normochromatic erythrocyte ，NCE))：淡桔红色⏹骨髓中PCE 数量充足，微核容易辨认，且微核自发率低，因此，成为微核试验的首选细胞群。

6一.实验目的和意义⏹1.了解小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验的实验原理及毒理学意义。

⏹2. 掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法。

7二.实验原理⏹微核试验检测外源化学物诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

实验三小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法。

二、实验原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。

微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。

一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。

所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。

由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。

三、器材与试剂1、器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片染、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。

2、试剂－甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液（取Giemsa染料lg，甘油66m1，甲醇60ml。

先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60oC水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。

该储备液存放的时，间越长，染色效果越好。

临用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液）、pH6.8的磷酸盐缓冲液。

（1）1/15mol/L磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液：称取分析纯KH2PO49.06g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

（2）1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液：称取分析纯Na2HPO49.45g/kg或Na2HPO42H2011.87g;Na2HPO47H2017.87g;Na2HPO412H2023.88g）用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

小鼠骨髓细胞微核试验一、目的与要求1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点;2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤,嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察;3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价;二、实验原理微核与染色体损伤有关,是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期遗留在细胞质中,末期之后,单独形成一个或几个规则的次核,包含在子细胞的胞质内,因比主核小,故称微核;无论是断片还是整条染色体,其实质都是遗传物质,一但发生畸变,就有能形成遗传物质方面的问题,造成突变,因此,微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测,现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标;微核试验是观察受试物能否产生微核的试验;主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂;传统的微核试验是体内试验,它观察骨髓嗜多染红细胞PCE中的微核;微核可位于多种细胞,但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分,所以只有在无核的红细胞中才易辨认;在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞呈灰蓝或浅蓝色和成熟红细胞呈粉红或桔红色两种,正常情况下嗜多染红细胞占多数,所以观察骨髓嗜多染红细胞;PCE指在红细胞成熟之前,最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞,但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体,因此Giemsa染色呈灰蓝色,成熟红细胞的核糖体已消失,被染成淡橘红色,使嗜多染红细胞在染色上与正常RBCNCE有所不同;微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成,也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成;三、实验设计1. 动物选择：常用小鼠,体重18~20 g,7~12周龄,每组10只,雌雄各半;2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径;3. 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒;两次染毒：第1次染毒后24小时进行第2次染毒,6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次,连续染毒5天,末次染毒后24小时取样;4. 剂量选择：至少设置3个剂量组;高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量;一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50剂量;当受试样品的LD50大于5 g/kg时,可取5 g/kg 为最高剂量,以下设3~5个剂量组;另设溶剂对照组阴性对照组和阳性对照组;阳性对照组可用环磷酰胺50~100 mg/kg或丝裂霉素C10 mg/kg腹腔注射1次;四、操作步骤1. 骨髓液的制备及涂片颈椎脱臼处死小鼠,取胸骨,擦净血污,剔去肌肉,剪去骨骺,将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片一端,另取一块边缘整齐的载玻片,在血清上轻轻按摩,使骨髓完全混匀,然后以45~50度角快速推片,推片后在空气中晾干;2. 固定将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15分钟,晾干;3. 染色将固定晾干后的涂片用新鲜配制的Giemsa应用液染色10~15分钟,然后用缓冲液冲洗掉玻片上的染色液,晾干;4. 观察计数先在低倍镜下进行观察,选择分布均匀,染色较好的区域,再在油镜下观察计数;嗜多染红细胞PCE通常为灰蓝色,一般被形容成多云的天空;正染红细胞NCE通常呈淡黄、橘黄等鲜艳明亮的颜色;微核多呈圆形,边缘光滑整齐,直径相当于细胞直径的1/20~1/5,染色与核质一致,呈紫红色或蓝紫色;一个细胞内可出现一个或多个微核;计数1000个PCE中含微核的PCE数嗜多染红细胞中出现两个或更多个微核,仍按一个微核细胞计算,并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值;五、结果分析及评价微核率以千分率表示;每只动物为一观察单位;每组的雌、雄动物分别计算微核PCE 的均值及标准差;雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果;正常的PCE/NCE比值约为1正常范围为~;如比值＜,则表示PCE形成受到严重抑制；如比值＜,则表示受试化学毒物的剂量过大,试验结果不可靠;阴性对照组及阳性对照组的微核发生率,应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致;。