实验生物学考试
部门：研发姓名：王晓婧8．叶敏设计一个制作抗小分子多肽单克隆抗体的流程
用杂交瘤技术制备抗小分子多肽单克隆抗体的主要步骤如下（示意图见下图）：
1、获得免疫的B淋巴细胞
用此小分子多肽作为抗原注射进小鼠体内，使其淋巴细胞产生相应的抗体。对小鼠做三次免疫，并在取其脾脏的前三天做一次加强免疫，可使得到的抗体亲和力较好，此过程中不用分离脾脏中的B细胞和T细胞，因为与骨髓瘤融合的过程本身就是一个选择B细胞的过程。
取与免疫小鼠同系的小鼠的骨髓瘤细胞，可用不分泌型和酶缺陷型，现多用酶缺陷型，缺乏TK（胸腺嘧啶核苷激酶）和HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）。
2、融合
可用化学融合法和电融合法等。常用的化学融合剂为PEG（聚乙二醇），其分子量越大，融合率越高，但同时毒性也越强，故用作细胞融合剂的PEG一般选用分子量为4000及以下的，在pH8.0～pH8.8左右的碱性环境中。电融合用电脉冲，无毒且融合率也高。
3、选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶Thymidine T）。在HAT 培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏TK和HGPRT，不能利用补救途径合成DNA，而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，故不可避免的要死亡。
停用HAT培养基后，用HT培养基。未融合的B细胞和T细胞在正常培养的情况下都会自然消亡。
这样，只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了TK和HGPRT，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能增殖。
4、筛选
在HA T培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此必须进行筛选。常用酶联免疫吸附测定（ELISA），筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
5、克隆化
对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌
的细胞所抑制。常用的克隆化方法有有限稀释法和FACS（荧光激活分选仪）分离法。
6、大量繁殖
单克隆抗体的大量制备可用体外培养法和腹水法。
克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。
而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制，取同系小鼠，先在其腹腔注入降植烷进行预处理，1～2周后腹腔注入杂交瘤细胞，一周后有明显腹水产生。用这种方法制备的腹水抗体含量高，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
