荧光定量PCR反应体系配制

HG miRNA SYBR Green PCR KitHG miRNA荧光定量PCR试剂盒Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl描述：HaiGene的HG miRNA SYBR Green PCR Kit使用Peter改良的miR-Q技术，采用特异性的上下游引物对反转录所得miRNA的cDNA产物进行定量检测【参考文献1】。

不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法，HaiGene采用双向特异性扩增引物（原理如图1），从而极大提高了miRNA的检测特异性，其可以区分极高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增（图2，3所示）。

该试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。

HG miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种，试剂盒编号为APXXXXX，每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒，可于HG miRNA qPCR kit.xls中查询。

如果您研究的mircoRNA分子不在我们的列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计。

该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化，确保扩增效率和特异性。

使用该方法进行miRNA 定量检测已被大量文献所采用【参考文献2～11】。

组分储存：避光置于-20°C，可保存2年；避免反复冻融注：其它miRNA荧光定量检测试剂盒见HG miRNA qPCR kit.xls。

图1：Peter改良miR-Q检测原理图图2：高效的扩增miRNAs图3：有效的区分相似度很高的miRNAsHG miRNA SYBR Green PCR KitHG miRNA荧光定量PCR试剂盒Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl操作方法1. 按以下组分配制反转录反应液microRNA（0.01-0.1 μg）or Total RNA 0.1-2 μg4×One step miRNA RT Solution 5 μl*10×miRNA RT Primer 2 μlRnase Free H2O Up to 20 μl2. 在PCR仪上按以下条件进行反应:37°C 60min95°C 5min3. 获得cDNA产物后使用HG miRNA荧光定量PCR试剂盒进行miRNA定量检测。

荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

荧光定量PCR 实验步骤：样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

实时荧光定量PCR目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。

在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。

因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量。

一、实验前准备：实验试剂及耗材：试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master1号管包含：热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2仪器及耗材：罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】二、反转录实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。

严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。

本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。

荧光定量PCR原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。

样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

实时荧光定量pcr的方法实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR），也称为荧光定量PCR，是一种常用于检测和定量DNA或RNA的分子生物学技术。

相比传统的PCR方法，实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度、准确性和特异性，能够量化目标核酸序列的含量。

实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应的进行和荧光信号的检测与实时监测。

PCR反应是通过逐渐升高的温度循环，使DNA链解链、引物与模板相互结合，合成新的DNA链，不断扩增目标序列的过程。

荧光信号的检测是通过加入特定的荧光探针，在PCR反应过程中的每个循环都量化目标序列的含量，并以荧光信号的强度来表示。

下面将详细介绍实时荧光定量PCR的方法及其一般步骤。

1. 样品处理与提取：首先需要从待测样品中提取出目标DNA或RNA的模板，并进行适当的处理。

比如，可以使用细胞裂解液或提取试剂盒来裂解和纯化细胞或组织中的核酸。

2. 反转录：对于需要检测的RNA目标，需要先将其反转录为cDNA。

这一步骤通常使用反转录酶和适当的引物，在一定的温度条件下合成cDNA。

反转录反应通常在37-42C进行。

3. 扩增反应体系制备：根据实验需要和反应装置的规格，配制好PCR反应的体系。

体系中的成分通常包括模板DNA（cDNA或DNA模板）、引物（前向引物和逆向引物）、荧光标记探针（如TaqMan探针）、聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTPs等。

4. PCR扩增条件设置：根据模板DNA的长度和序列特性，设置PCR反应的温度和时间条件。

通常，PCR反应的温度包括初始变性（95C）、扩增（56-72C）和延伸（72C）等多个循环。

5. 荧光信号的检测与实时监测：PCR反应过程中，可以通过专用的实时荧光定量PCR仪器进行检测和监测。

这类仪器常常能够实时记录PCR反应的荧光信号强度，并产生实时的反应曲线图。

根据荧光信号的强度变化，可以推断目标DNA 或RNA的含量。

荧光定量pcr检测步骤嘿，朋友们！今天咱就来唠唠荧光定量PCR 检测步骤这档子事儿。

你想想看啊，这就好比一场奇妙的旅程。

首先呢，咱得把要检测的样本准备好，这就像是给旅程准备行囊，可不能马虎呀！样本得纯净，不能有杂七杂八的东西捣乱。

然后呢，就是设计引物啦！这引物就像是旅程中的指南针，得特别精准，才能指引我们往正确的方向走。

设计得不好，那可就容易迷路啦，检测结果也会乱七八糟的。

接下来，就是配制反应体系啦！各种试剂就像旅途中的伙伴，得搭配好，让它们和谐共处，共同发挥作用。

这可不是随便倒倒就行的，得精确再精确。

再之后，把样本和反应体系混合好，放进PCR 仪里。

这PCR 仪啊，就像是旅程中的交通工具，带着我们的样本和反应体系一路前行。

在这个过程中，温度会不断变化，就像车子在不同的路况下行驶一样。

在 PCR 仪里跑了一段时间后，就到了检测荧光信号的时候啦！这荧光信号就像是旅途中的美景，我们得仔细观察，不能错过任何一个精彩瞬间。

嘿，你说这荧光定量 PCR 检测是不是很有意思？就像一次充满挑战和惊喜的冒险！每一步都得小心翼翼，却又充满期待。

要是哪一步出了差错，那可就前功尽弃啦！所以啊，做这个检测的时候，可得打起十二分的精神来。

就像你去旅行，总不能稀里糊涂的吧！得认真准备，认真对待每一个环节。

你想想，如果因为自己的不小心，导致检测结果不准确，那得多郁闷呀！这可关系到很多重要的事情呢，比如疾病的诊断、科学研究的进展。

哎呀，说了这么多，相信你对荧光定量 PCR 检测步骤也有了一定的了解啦！总之，认真对待，就像对待生活中的每一件重要事情一样，准没错！希望大家都能在这个奇妙的检测世界里顺利前行，得到准确又可靠的结果哟！。

荧光定量PCR实验原理及数据分析1.前处理：首先对待测样本进行DNA提取，并且根据需要可对DNA进行适当的纯化和稀释处理。

2. 反应体系的准备：将PCR反应所需的各种试剂组装到反应管中，包括模板DNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix等。

其中荧光探针是含有特定标记荧光分子及其互补序列的寡核苷酸。

3.反应机使用条件的设定：根据所需扩增目标的不同，设置适当的反应条件，包括温度控制、循环次数和步骤等。

4.PCR反应过程监测：在PCR反应的过程中，通过荧光信号的实时监测来定量检测目标DNA。

在扩增过程中，如果靶标DNA存在，则引物与目标DNA结合，荧光探针被引物酶切释放出来，从而增大荧光信号。

5.数据收集与分析：实时采集PCR反应过程中的荧光信号，并通过相应的软件进行数据分析。

常见的荧光曲线分析方法有阈值循环数法（Ct 法）和相对定量法（ΔCt法）等。

在数据分析方面1.Ct值分析：阈值循环数法（Ct法）是一种常用的数据分析方法。

通过设定一个荧光信号的阈值（通常为反应曲线的背景荧光信号的两倍标准差），根据荧光信号的曲线与阈值的交点来计算Ct值。

Ct值越小，说明目标DNA起始含量越多。

2.标准曲线分析：通过引入已知浓度的标准品，制作一条标准曲线。

根据标准曲线，可以推算出待测样本中的靶标DNA的含量。

3.相对定量分析：采用相对定量法（ΔCt法）来比较两个不同样本间的靶标DNA的表达量。

通过比较目标基因与内参基因（如表达稳定的参考基因）的Ct值，计算两者Ct值间的差异（ΔCt），进而得到靶标基因的表达差异。

4.绝对定量分析：通过构建外部标准曲线或使用串联基因的方法，直接定量目标DNA的浓度。

总之，荧光定量PCR技术在医学、生物学和分子生物学等领域的应用非常广泛，对荧光信号的实时监测及数据分析能够提供准确快速的定量结果，为研究者们提供了一个强大的实验工具。

荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。

该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。

荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。

在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。

荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。

实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。

数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。

通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。

数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。

荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。

通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。

1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。

该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。

荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。

荧光定量PCR操作流程一、RNA提取准备物品：无RNA酶大中小枪头；一套枪；trizol试剂；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；DEPC水；氯仿；75%DEPC乙醇；异丙醇等1、1mLTrizol样品加200uL氯仿，用力晃动15s2、冰上静置5min3、4℃12000rpm 离心15min4、小心吸取上清水相400-500uL至新的无酶EP管5、按照体积1:1加异丙醇，颠倒混匀6、置于冰上30min7、4℃12000rpm 离心10min8、倒掉上清，加入500uL75%DEPC乙醇，轻弹管底使RNA沉淀漂起9、4℃12000rpm 离心5min10、吸上清弃掉，尽量吸干净11、12000rpm 离心5min12、吸上清弃掉，尽量吸干净，开盖超净台内凉置5min13、每管加20uLDEPC水溶解，弹管底使溶解混匀14、56℃助溶10min15、置于冰上测RNA浓度（Gen5 核酸检测执行）16、擦手纸蘸蒸馏水擦RNA浓度检测板加样孔，再用擦镜纸擦干17、1234孔各加2uLDEPC水，检测，本底为绿色即可继续测样本（2uL）18、依次按编号加入2uL样本，软件关闭后重新打开，选择样本检测19、批准出结果260/280=1.8-2则样品合格二、反转录qPCR准备物品：无RNA酶大中小枪头；无RNA酶EP管（1.5mL、200uL）；RTmix；DEPC水1、计算1000ng（反转录RNA上样量1000ng）的RNA体积，必要时稀释2、反转录体系20uL（RTmix 4uL ；RNA样品约2uL ；DEPC水补齐20uL ）3、弹管底混匀瞬时离心4、Bio-rad 中间选项takaraRT run 16min5、dd水稀释cDNA，使cDNA浓度约为10ng/uL，100uL分装后-20℃保存三、荧光定量PCR准备物品：8联管；引物；cDNA；200uLEP管；无菌枪头1、引物稀释dd水溶解稀释引物，旋涡混匀，引物储存浓度10nM/uL2、定量PCR10uL体系引物F 0.4uL引物R 0.4uLcDNA 1uL(终浓度为1ng/uL)SYBR 5uL(含染料、DNA扩增酶、DNTP、Mg2+、扩增缓冲液等)dd水3.2uL3、布板一个指标三个重复4、取10个200uL无酶EP管，按顺序编号123456789105、按照一个指标：六个孔+2个孔（防止枪误差导致各孔不均）=8孔的剂量配制混合：引物F 0.4uL*8=3.2 uL引物R 0.4uL*8=3.2 uLSYBR 5uL*8=40 uLdd水3.2uL*8=25.6 uL6、按照布板依次加入8联管中（置于冰上），最后每孔加1 uL cDNA（P5 P10 cDNA不同），设置不加cDNA模板的阴性对照。

荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。

其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。

荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。

2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。

因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。

TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。

在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。

只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。

荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。

cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。

2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。

3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。

4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。

反转录及荧光定量步骤反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和测量特定的RNA分子在生物样品中的相对表达水平。

RT-PCR的步骤主要包括反转录（RT）和荧光定量（PCR）两个主要阶段。

一、反转录步骤反转录是将目标RNA转录为相应的DNA模板的过程。

该步骤通常用于鉴定和定量RNA分子的相对表达水平。

1. RNA提取和纯化：首先需要提取细胞或组织中的总RNA。

目前常用的方法是使用TRIzol试剂将RNA从样品中提取出来，并使用纯化试剂将RNA从其他杂质中纯化出来。

2. 反转录酶的选择：选择适合反转录的酶，如逆转录酶（Reverse Transcriptase）。

逆转录酶是一种能够在RNA模板上合成DNA的酶，如M-MLV逆转录酶和Superscript III逆转录酶。

酶的选择应基于实验的需求和特定的RNA样本。

3. 反转录反应体系：反转录反应需要适当的缓冲液、酶、反转录引物（primers）和RNA模板。

引物是一种寡聚核苷酸序列，它们在反转录反应中提供一个起始点供DNA合成酶进行延伸。

引物的设计应基于目标RNA的序列和实验设计。

4.反转录反应条件：反转录反应一般需要在适当的温度和时间下进行。

常见的反应条件包括：37-42°C的温度，60分钟至120分钟的反应时间，以及常规的反应缓冲液。

5.反转录反应停止：反转录反应通常通过加热或其他方法停止。

加热反应体系可以选择不同温度和时间进行优化。

荧光定量PCR是一种用于定量测量PCR产物数量的方法。

它利用荧光标记的引物和探针来监测PCR反应过程中的DNA合成。

1.PCR体系的组装：PCR体系包括适当的缓冲液、DNA模板、引物、酶和荧光探针。

引物是用于引导DNA合成的寡聚核苷酸序列，探针是一种含有一个荧光标记和一个荧光猝灭剂的寡聚核苷酸序列。

2.PCR反应条件：荧光定量PCR反应需要在适当的温度和时间下进行。

一般反应条件包括：95°C的初始变性步骤，95°C变性反应30秒，50-68°C的退火温度/延伸温度，延伸时间根据引物的大小而定。

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