一. 土壤样品的采集
第一种: 选择植被群落具有代表性的固定样方,除去地面植被和地表覆盖物,每样方采用土壤剖面法和多点混合取样法采样,将土样混匀,用四分法弃去多余样品,取500g装入灭菌信封, 带回实验室后立即进行土壤微生物分离（4℃保存）、计数。
第二种: 在小区内机械抽取 6 株样木，距树干基部0.5 m 呈梅花形分布挖取根系周围0～20 cm、20～40 cm 和40～60 cm 土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。同时采集各层直径小于0.2～0.5 cm 细根上粘附的土壤，分层充分混合作为根际土壤。供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带入实验室。
二. 三大类土壤微生物分离与数量测定
1. 细菌的分离与数量测定
(1)以平板表面涂抹法计数。称取土壤鲜样10g在无菌条件下用无菌水配成不同浓度梯度悬浮液，取稀释度为10-3，10-4，10-5，10-6，10-7土壤悬浮液各50μL，接种于盛有灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的培养皿中,用无菌刮刀涂抹均匀。每个浓度3个重复，恒温(28 ℃) 培养3d，选取每皿菌落数为15-150的1个稀释度统计菌落数，按下列公式计算细菌数量：
菌数(cfu/ g) = （菌落平均数×稀释倍数）÷干土% （Ⅰ）
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，配方如下：
牛肉膏3.0 g 琼脂18 g 蛋白胨5.0 g 蒸馏水1000mL pH7.0 —7.2 2. 真菌的分离与数量测定
以平板表面涂抹法计数。即称取土壤鲜样10 g ,在无菌条件下用无菌水配成不同浓度梯度悬浮液,取稀释度为10-2，10-3，10-4的土壤悬浮液各50μL，接种于盛有灭菌的马丁- 孟加拉红培养基的培养皿中,用无菌刮刀涂抹均匀。每个浓度3个重复,恒温(25 ℃) 培养5～7 d，选取每皿菌落数为15～150 的1个稀释度统计菌落数计算真菌数量公式同公式（Ⅰ）。
马丁- 孟加拉红培养基，配方如下：
葡萄糖10.0 g MgSO4.7H2O 1.0 g KH2PO4 1.0 g 琼脂15 g 蛋白胨 5.0 g 孟加拉红(Rose Bangal) 每升加1%溶液0.33mL 1% 链霉素3 mL 蒸馏水1000 mL pH自然
临用前再加入1% 链霉素3 mL
3. 放线菌数量测定
以平板表面涂抹法计数。除取稀释度为10–3，10–4，10-5的土壤悬浮液各50μl接种于盛有灭菌的改良高氏一号培养基外，其余与细菌数量测定方法相同。恒温(28℃) 培养7～10 d，按上述方法和公式统计菌落数并计算细菌数量。
培养基改良高氏一号培养基，配方如下：
可溶性淀粉20g KNO3 1.0g FeSO4.7H2O 0.01g K2HPO4 0.5g MgSO47H2O 0.5g NaCl 0.5 g 琼脂18 g K2Cr2O40.01 g 蒸馏水1000 ml pH7.2 ～7.4
临用时加10%重铬酸钾1ml/300ml, 抑制细菌生长
二.土壤各类微生物生理群落数量测定
1. 好气性纤维素分解菌数量测定
好气性纤维素分解菌数量测定采用平板表面涂抹法计数。在灭菌的盛有赫奇逊氏培养基的培养皿中放一块直径与培养皿等大的灭菌无淀粉滤纸(事先用1%稀醋酸浸泡一昼夜，并用2%的苏打水洗到中性)，用干净、灭菌的玻璃刮刀压平。取稀释度为10-2，10-3，10-4的土壤悬浮液各50ｕl，接种于附有滤纸的培养基中，用无菌刮刀涂抹均匀。每个浓度3个重复，恒温(28℃)培养14d-18d，按上述方法和公式(Ⅰ)统计菌落数，计算每g干土中的菌数。
培养基配方如下:
羧甲基纤维素纳10g (NH4)2SO40.5 g KH2PO4 1.0 g CaCl20.1 g MgSO40.2 g 琼脂20 g 蒸馏水1000 ml pH7.2—7.3 培养基采用赫奇逊( Hutchinson )氏培养基，配方如下:
KH2PO41.0 g NaNO32.5 g NaCl 0.1 g CaCl20.1 g 琼脂20 g MgSO4. 7H20 0.3 g FeCl3 0.01 g 蒸馏水1000 ml pH7.2—7.3 2. 嫌气性纤维素分解菌数量测定
嫌气性纤维素分解菌数量测定采用稀释法。分别将15 ml培养基分装于试管中(深层造成嫌气条件)。各管插入1条1cm×10cm滤纸条，一个大气压灭菌30min。将稀释浓度为10-2，10-3，10-4，10-5的土壤悬液1 ml接入试管，每稀释度重复3次。另取3支试管接种lml无菌水作对照，于28 —30℃培养14d—18d，取出检查滤纸上的溶解区或纸屑的腐烂情况，并观察滤纸条上是否出现菌落，以判断嫌气性纤维素分解菌
的生长。若在滤纸上生长，则常缀上黄色、褐色或黑色的斑点。滤纸条一摇动立即破裂。根据检查得出数量指标，然后根据数量指标查Mecrady表，得出菌数近似数，按公式(2)计算出每g干土中嫌气性纤维素分解菌的数量。
培养基采用奥曼粱斯基培养基，配方如下:
(NH4)2SO4 1.0g K2HPO4 1.0g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.2g CaCO3 2.0g 蒸馏水1000m1
3. 自生固氮菌数量测定
好气性自生固氮菌数量测定采用平板表面涂抹法计数。除恒温(28℃)培养7d——l0d外，与真菌分离及其数量测定方法相同。(除取稀释度为10–3，10–4，10-5的土壤悬浮液各50μl接种于盛有灭菌的改良高氏一号培养基外)
培养基采用改良阿须贝(Ashby)无氮琼脂培养基，配方如下：
葡萄糖l0.0g K2HPO40.2g K2SO40.2g NaCl 0.2g CaCO3 5g MgSO4.7H2O 0.2 g 琼脂18.0 g 蒸馏水1000 ml 4. 反硝化细菌数量测定
采用稀释法。分别将15 ml 培养基分装于试管中（造成嫌气条件）。一个大气压灭菌20min。将稀释度10–2，10–3，10–4，10–5，10–6的土壤悬浮液1 ml接入试管，每稀释度重复3 次。领取试管接种1ml 无菌水作对照，与28-30℃培养14d，检查有无细菌生长，如有菌生长，一般有气泡出现，培养液浑浊。同时使用奈氏试剂检查是否有氨产生（加入奈氏试剂，若有氨产生，则由黄色或褐色沉淀出现）。再用格利斯试剂检查是否有NO2-出现（加入格利斯试剂，若有NO2-出现，则呈红色），并用二苯胺试剂检查是否有NO3-出现（加入二苯胺试剂，若有NO3-出现，则呈蓝色）。根据检查得出数量指标，然后根据最大然或法查Mecrady 表，得出菌数近似数，计算公式同公式（Ⅰ）。
培养基采用组合培养基，配方如下：
蛋白胨20.0g 葡萄糖1.0g NaHPO4 2.0g KNO3 1.0g 琼脂1.0g 蒸馏水1000ml
三氮显色试剂配制与使用（氨氮、亚硝态氮和硝态氮）
奈氏试剂的配制：
将10g碘化汞和7g碘化钾溶于10ml水中，另将24.4g氢氧化钾溶于内有70ml水的
