土壤微生物量碳氮测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

土壤微生物量的测定一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）1、试剂配制（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。

方法是量取适量的分析纯氯仿，按1 2（v : v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1mol L-1]（3）硫酸钾浸提剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：取1742.6 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1），溶解24 h。

（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。

注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。

注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。

（6）磷酸溶液（21%）：37ml 85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。

（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。

2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomasS不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。

近40 年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。

由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳（Microbial biomass carbon, Be来表示土壤微生物生物量的大小。

测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigatio n-i ncubatio n. Fl）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。

熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加-1入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。

Voro ney（1983）发现熏蒸土壤用0.5mol LK2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。

Vanee等（1987）建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol L-1K2SO4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC取值0.38）来计算土壤微生物碳。

Wu 等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。

该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。

林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。

对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的14研究。

测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。

首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。

将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。

另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。

其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。

浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。

熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。

微生物量碳、氮的转换系数为0.45。

土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳氮磷测定方法一、试剂配制微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。

10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳氮测定方法土壤微生物量碳氮测定是评估土壤有机质含量和土壤微生物活性的重要方法之一、它可以帮助我们了解土壤中有机质的分解和氮素的转化过程，对土壤健康和养分循环有重要意义。

下面将从土壤微生物量碳氮的测定原理、方法以及应用等方面进行详细的阐述。

一、原理与意义：土壤微生物量碳（Microbial Biomass Carbon, MBC）是土壤中微生物所含有的碳量，包括微生物本体的碳和微生物产生的胞外有机物的碳。

土壤微生物量氮（Microbial Biomass Nitrogen, MBN）则是土壤微生物所含有的氮量。

土壤微生物量碳氮的测定主要利用的是微生物生物量对有机碳氮的吸收和蓄积能力，在土壤中有机质降解与微生物活动之间存在着紧密的关系。

测定土壤微生物量碳氮的主要意义在于：1.评估土壤质量：土壤微生物是土壤中的重要组成部分，对土壤生态系统的功能发挥起着重要作用。

通过测定土壤微生物量碳氮，可以判断土壤中的微生物含量和活性，进而评估土壤的质量和健康状况。

2.预测土壤肥力：土壤微生物参与了有机质的降解和养分的转化过程，因此它们的代谢活动直接影响土壤肥力。

测定土壤微生物量碳氮可以预测土壤中有机质的分解速率和养分的供应状况，为合理施肥提供依据。

3.监测土壤生态系统的健康：土壤微生物对环境变化非常敏感，其数量和活性的变化可以反映土壤生态系统的稳定性和健康状况。

通过定期测定土壤微生物量碳氮，可以监测土壤生态系统的变化，帮助我们了解土壤的自净能力和恢复能力。

二、测定方法：目前，常用的土壤微生物量碳氮测定方法主要有不同源于Chen et al. (1998) 和Jenkinson及仪器方法（如戴弗尔仪器、百威仪器等）。

1.直接抑制剂法：该方法基于土壤微生物量碳氮含量对微生物生长的抑制作用。

通过向土壤样品中加入抑制剂（如消费抑制剂氟愈刀或氯化丙夫），抑制土壤中微生物的生长，然后测定加入抑制剂后土壤中微生物量碳氮的变化。

微生物量碳氮测定方法微生物量、碳氮测定方法是研究微生物数量和代谢活性的关键手段，可用于土壤、水体和生物体等环境中的微生物研究。

常用的微生物量、碳氮测定方法包括显微镜计数法、流式细胞术、气体产量法、碳氮比测定法等。

下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。

一、显微镜计数法显微镜计数法通过显微镜观察和计数微生物的数量来测定微生物量。

其原理是将样品置于显微镜下，在显微镜下观察样品中的微生物数量，并进行计数。

根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中微生物的数量。

显微镜计数法的操作步骤如下：1.获取样本并制备薄片。

根据需要采集样本，并将样本制备成薄片或涂片。

可以使用高温固定、化学固定或热固定等方法固定样本。

2.显微镜观察和计数。

将固定的样本放入显微镜下，通过放大镜头观察样本中的微生物，并进行计数。

为了避免重复计数和遗漏计数，可以使用方格计数器。

3.根据计数结果计算微生物量。

根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中的微生物数量。

通常计算结果以每克（或每升）样品中的微生物数量表示。

二、流式细胞术流式细胞术是用于计数、分类和分析微生物的一种高通量、高精读的方法。

其原理是将样品中的微生物通过细胞色素或抗原标记，通过流式细胞仪进行激光扫描，扫描到的细胞信号通过计算机进行分析，从而得到微生物的数量、大小和类型等信息。

流式细胞术的操作步骤如下：1.准备样品和染色。

根据需要采集样本，并给样本进行染色。

染色可以使用细胞色素或抗原标记法，将需要测定的微生物区分出来。

2.流式细胞仪扫描。

将染色的样品装入流式细胞仪中，通过激光扫描仪器扫描染色的细胞，并记录扫描到的细胞信号。

3.数据分析。

通过计算机分析扫描到的细胞信号，得到微生物的数量、大小和类型等信息。

三、气体产量法气体产量法是通过测定微生物代谢过程中产生的气体来间接测定微生物的数量和代谢活性。

常用的气体产量法有氧呼吸测定法和甲烷产量测定法。

气体产量法的操作步骤如下：1.准备培养基和反应器。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

土壤微生物量碳测定方法土壤微生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）是指活体微生物在土壤中的碳含量，是土壤微生物数量的指标之一，反映了土壤中微生物活动的水平。

测定土壤微生物量碳的方法有多种，包括气体护膜冻融法、氟化钠浸提法、氯仿蒸腾法等。

下面将介绍常用的土壤微生物量碳测定方法。

一、气体护膜冻融法（gas chromatographic method with chloroform fumigation extraction，CFE-GC）气体护膜冻融法是一种基于微生物细胞内的总碳测定方法。

具体操作步骤如下：1.取一定量土壤样品，将样本均匀摊在烟斗滤纸上；2.用氯仿制备一定浓度的蒸腾液；3.将氯仿蒸腾液均匀喷洒在土壤样品表面；4.将喷洒后的土样与烟斗滤纸一起放入长颈瓶中，用橡皮塞封口；5.将长颈瓶放入液态氮中，使其迅速冷冻；6. 将冷冻后的样品研磨至细腻，并与含量已知的标准样一起送入气相色谱仪（gas chromatograph，GC）进行测定；7.根据标准曲线计算土壤微生物量碳含量。

二、氟化钠浸提法（NaF method）氟化钠浸提法是一种利用氟离子抑制土壤中微生物的酶活性，从而测定微生物量碳含量的方法。

具体操作步骤如下：1.取一定量土壤样品，加入含有一定浓度的氟化钠溶液；2.震荡混合一段时间，使土壤中的微生物碳与氟离子进行结合；3.将样品置于高速离心机中离心，分离土壤颗粒与液相；4.将上清液倒入瓶中，加入酸进行中和；5.酸中和后，将溶液进行干燥，得到土壤微生物量碳的干重；6.根据干重计算土壤中微生物量碳的含量。

三、氯仿蒸腾法（chloroform fumigation-extraction，CFE）氯仿蒸腾法是一种基于微生物细胞内溶质增加量来计算微生物量碳的方法。

具体操作步骤如下：1.取一定量土壤样品，将样本均匀摊在烟斗滤纸上；2.用氯仿蒸腾液均匀喷洒在土壤样品表面；3.将氯仿蒸腾的土样与烟斗滤纸一起放入密封瓶中，使其在常温下进行蒸发；4.将蒸发后的土样与烟斗滤纸一起进行提取，得到提取液；5.对提取液进行化学分析，测定其中的微生物量碳含量；6.根据微生物量碳的含量计算土壤中微生物量碳的含量。

土壤微生物学特征的测定一土壤微生物量碳、氮的测定将新鲜的土壤样品含水量调节至田间含水量的30%~50%，25℃下密封预培养7~10d,以保持土壤均匀和不同的地方所得结果的可比性。

然后迅速测定土壤微生物量碳氮，或在低温4℃下保存。

采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法测定土壤微生物量碳氮，即称取预处理的湿润土壤每份20.0g（烘干基重）放入50ml烧杯中，将其置于底部有少量NaOH、少量水（约200ml）和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3-5min；然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。

将熏蒸好的土壤转移到200ml提取瓶中，加入约80ml0.5mol/LK2SO4提取液（土水比为1∶4），振荡30min后过滤，得土壤提取液每份土样重复3次。

同时做未熏蒸空白和试剂空白。

土壤微生物量碳：用重铬酸钾氧化法测定吸取10ml土壤提取液于150ml消化管中，加入0.2mol/LKCrO和浓硫酸各5.0ml，再加入少量沸石，混匀，于175℃磷酸浴中煮沸10min。

冷却后全部移入150ml三角瓶中，使总体积约80ml，加入2滴邻啡罗啉指示剂，用0.05mol/LfeSO滴定至砖红色。

土壤微生物量碳（Bc）=Ec/Kc，Ec表示未熏蒸与熏蒸对照土壤的浸取有机碳的差值，Kc未转换系数，取值0.38。

土壤微生物量氮：用凯氏定氮法测定取20ml土壤提取液于250ml消化管中，加入0.19mol/LcuSO溶液0.4ml、浓硫酸6.7ml 消化至澄清，冷却后进行定氮。

土壤微生物量氮（Bn）=En/Kn，En为熏蒸与未熏蒸对照土壤矿质态氮的差值，Kn为转换系数，取值0.45。

二土壤酶活性的测定土壤过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法、脲酶活性用靛酚蓝比色法测定。

过氧化氢酶活性以20min后每克土消耗。

0.02mol/L高锰酸钾毫升数表示，脲酶活性一24h后每百克土NH3-N的毫克数表示。

微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。

之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。

2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。

使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。

上述处理均在通风橱里操作。

3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。

若是气密性不好，使用少些凡士林密封。

步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。

2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。

3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。

4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。

微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法熏蒸提取法是一种常用的微生物碳氮测定方法，主要用于土壤、沉积物和水体等环境样品中微生物碳氮的测定。

该方法的原理是通过熏蒸操作将样品中的微生物碳氮转化为气态的有机碳和氨氮，然后采用适当的仪器进行测定。

熏蒸提取法的操作步骤如下：1.制备样品：首先需要将待测样品进行适当处理，例如将土壤样品通过筛网筛分细粒土壤，去除杂质并获得均匀的样品。

2.准备熏蒸试剂：通常采用硝酸钠和过氧化氢作为熏蒸试剂。

将一定量的硝酸钠和过氧化氢溶解在适量的蒸馏水中，制备成一定浓度的熏蒸试剂。

3.装填样品：将经过处理的样品装填入适当的装填容器中，容器的底部通常需要加入一层石蜡以防止样品颗粒溢出。

4.装置熏蒸装置：将装填好样品的容器放入熏蒸装置中，使其与熏蒸试剂充分接触，并保证装置的密封性。

5.熏蒸操作：打开熏蒸装置，让熏蒸试剂蒸气渗透到样品中。

通常可以通过加热和搅拌等方法加快熏蒸的速度。

6.采样：在一定时间的熏蒸后，关闭熏蒸装置，将装填容器取出。

此时，样品中的微生物碳氮已经转化为气态的有机碳和氨氮。

可以通过适当的方法（例如吸附管）采样气相中的有机碳和氨氮。

7.测定：采集好的气相样品可以通过气相色谱、气相质谱等方法进行测定。

有机碳和氨氮的含量可以通过标准曲线或其他相关方法得到。

熏蒸提取法在微生物碳氮测定中具有一定的优点和适用性：1.简便快捷：相对于其他常用的微生物碳氮测定方法，熏蒸提取法操作简单，只需经过几个基本步骤即可得到气相样品。

2.高效准确：熏蒸提取法可以将样品中的微生物碳氮充分转化为气态，提高了测定效率和准确性。

3.适用范围广：熏蒸提取法可以应用于多种环境样品的微生物碳氮测定，如土壤、沉积物和水体等。

4.可检测多种有机碳和氨氮：通过熏蒸提取法得到的气相样品中可以同时测定多种有机碳和氨氮的含量，使分析更加全面。

当然，熏蒸提取法也存在一些局限性：1.适用样品有限：由于熏蒸提取法需要样品能够充分接触熏蒸试剂，对于一些粘稠或颗粒较大的样品，可能会影响熏蒸的效果。

1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。

1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。

2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。

直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。

直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。

现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。

本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。

二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。

二、试剂1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。

将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。

2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。

四、操作步骤称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。

将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。

抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。

熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。

另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。

将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。

土壤微生物碳、氮测定方法—熏蒸提取法1、提取液的制备：仪器：抽气皿、无醇氯仿，抽气机，大铝盒，分析天平，小三角瓶（50ml）、大塑料瓶（250ml），三角瓶（100ml）。

试剂的制备：无醇氯仿（提取方法：用1N硫酸溶液（0.5mol/l）与氯仿按体积比2：1于分液漏斗中震荡混匀，静置分离，共做三次，再用去离子水代替硫酸与氯仿2：1混匀，震荡分离，共三次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠保存。

）分析步骤：1、称取12.5g鲜土于大铝盒中，在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，放几张小纸片以便于观察沸腾，放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机，盖上黑布，置于阴暗处（25℃）熏蒸24小时，到时间后，取回小烧杯，后反复抽真空3~5次，排除氯仿。

2、另称取一批同等重量的土放入干燥器中作未熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。

3.将上述步骤中的两批土样转移到大塑料瓶中（此操作应尽快进行）每个瓶内50ml0.5M硫酸钾溶液，盖紧瓶塞，（160—180r/min）震荡30分钟，取出，用定量滤纸过滤到100ml大三角瓶中，应立即测定，如果不立即测定，可用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在4℃的冰箱中24小时。

微生物氮的测定—消煮，碱化蒸馏法仪器：定氮仪，烘箱，开氏瓶（50ml），移液管（2，5，25ml），小漏斗，小三角瓶（150ml）试剂的制备：去离子水，浓硫酸（化学纯），硼酸指示剂，10M氢氧化钠（化学纯），硫酸铜溶液。

分析步骤：吸取上述步骤中的过滤液25ml放入到开氏瓶中，加入2ml浓硫酸（固定滤液中的氨），放入到烘箱中在60~70℃烘2~3天，直至瓶内还剩下3ml左右滤液，取出加入3ml浓硫酸和1ml硫酸铜溶液，放上小漏斗在电炉上消煮，消至瓶内颜色呈天蓝色（半小时左右）为止，取下冷却，同时用0.5M硫酸钾溶液25ml 代替滤液做空白。

用去离子水洗净小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml10M氢氧化钠溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接受蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时停止蒸馏，蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道、用1/2硫酸标液（0.01）滴定馏出液，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录数据。

土壤微生物生物量(碳、氮）的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。

耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。

近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。

目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。

氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。

通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。

二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。

方法为：量取500ml氯仿于1000ml 分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。

再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。

将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。

2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。

微生物碳氮磷测定(总4页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除土壤微生物量碳氮磷测定方法一、试剂配制二、微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph 至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。

10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。